米诺膦酸原料药中4种有机残留溶剂的毛细管气相色谱法测定

杨镇伟， 林琪， 吴振， 刘智阳， 王立强

(1. 华侨大学 生物医学学院， 福建 泉州 362021；2. 厦门大学 药学院， 福建 厦门 361102；3. 中铭生物(深圳)集团有限公司， 广东 深圳 518101)

米诺膦酸(minodronic acid)是一种双膦酸盐化合物，为日本小野药品株式会社和日本Astellas制药株式会社共同研究开发，可用于治疗原发性和继发性骨质疏松症[1].作为第三代双磷酸盐类抗骨吸收剂，米诺膦酸能够抑制破骨细胞法尼焦磷酸合成酶(FPP)的活性，降低骨转换，进而防治骨质疏松[2-4].据文献报道，其抑制骨吸收的体外活性约为依地膦酸盐的10 000倍，阿仑膦酸盐的10～100倍[5].在诸多药物的合成过程中需使用有机溶剂，这些有机溶剂对人体存在不同程度的毒性，当原料药及制剂中残留有机溶剂超过安全水平，则会对人体造成损害.因此，为了提高药物的安全性，对原料药及制剂中残留溶剂的检测至关重要.

目前，国内已有对米诺膦酸含量测定及有关物质测定的报道[6-8]，米诺膦酸也有多种合成路线[9-10].然而，有关米诺膦酸中残留溶剂检测的报道仅有吴素平等[11]，即对四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲苯等5种残留溶剂进行检测，其检测限分别为0.16，0.10，1.19，0.22，0.02 μg·mL-1.甲醇、二氯甲烷和甲苯属于第二类有机溶剂，乙醇属第三类有机溶剂，目前尚无长期毒性试验结果.关于药物中乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯等残留溶剂检测的报道有许多，如张巍等[12]对依帕司他中有机残留溶剂的检测，裴丽娟等[13]对布南色林原料药中9种有机残留溶剂的检测等.但这些对乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等残留溶剂的检测限均较高.本文采用袁淑杰米诺膦酸合成新工艺制备米诺膦酸原料药[14]，并对合成过程中使用的乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4种有机残留溶剂进行定量分析.

1 实验部分

1.1 实验仪器

毛细管气相色谱仪(氢火焰离子检测器，浙江福立分析仪器股份有限公司)；电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；超声波清洗仪(河南省巩义市予华仪器有限责任公司)

1.2 实验材料

乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯均为色谱级，水为超纯水，其余试剂均为市售分析纯.

1.2 实验方法

1.1.1 色谱条件 采用安捷伦DB-624(0.32 mm×30 m， 3 μm)色谱柱；固定液为6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷；初始温度为40 ℃，保持3 min，以15 ℃·min-1持续升温至200 ℃，并保持10 min；检测器温度为200 ℃，进样口温度为250 ℃，载气为N2，柱流量为1.5 mL·min-1；采用直接进样法测定.

1.1.2 溶液的配制 1) 供试品溶液的配制.分别精密称取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺分别稀释制备成浓度为0.500，0.300，0.060和0.089 mg·mL-1的溶液，作为峰定位试验的供试品溶液.2) 线性母液的配制.分别精密称取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分别稀释制备成浓度为50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的溶液，作为线性母液.3) 混合溶液的配制.分别精密称取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺稀释制备成浓度分别为50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的混合溶液.4) 对照品母液的配制.分别精密称取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分别稀释制备成浓度为5.00，3.00，0.60和0.89 mg·mL-1的溶液，作为对照品母液.

2 实验结果与分析

2.1 系统适应性考察

分别精密量取1 μL供试品溶液及N，N-二甲基甲酰胺，注入毛细管气相色谱仪，其毛细管气相色谱(GC)图如图1(a)～(e)所示.图1(a)～(e)中：A为峰面积；t为洗脱时间，下同略.由图1(a)～(e)可知：乙醇的保留时间为5.116 min，甲醇的保留时间为4.359 min，二氯甲烷的保留时间为6.130 min，甲苯的保留时间为11.138 min，N，N-二甲基甲酰胺的保留时间为12.405 min.

精密量取1 mL混合溶液于容量瓶，用N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度，摇匀，取1 μL注入毛细管气相色谱仪，其毛细管气相色谱(GC)图如图1(f)所示.由图1(f)可知：本品各主峰之间的分离度均符合规定.因此，上述毛细管气相色谱条件，可用于本品的溶剂残留检查.

(a) 空白溶剂 (b) 乙醇

(c) 甲醇 (d) 二氯甲烷

(e) 甲苯 (f) 混合溶液图1 不同溶液的毛细管气相色谱图Fig.1 Capillary gas chromatograms of different solutions

2.2 线性关系和检出限的考察

分别精密量取0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL的中线性母液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀释定容，并振荡摇匀，作为线性溶液.然后，分别精密量取1 μL线性溶液，进样，记录色谱图及峰面积.以各个峰面积(A)作为纵坐标，以线性溶液的浓度(c)作为横坐标，进行线性回归，计算线性回归方程及相关系数(R2).4种溶剂分别用N，N-二甲基甲酰胺稀释直至峰高与基线噪音的比值约为3时，记录样品浓度即检测限，结果见表1所示.

表1 不同溶剂的线性关系及其检出限Tab.1 Linear relationship of different solvents and their detection limits

2.3 精密度试验

分别精密量取1 mL混合溶液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀释定容，并振荡摇匀.精密量取上述溶液1 μL，连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示.表2中:DRS为相对标准偏差.从表2可知：精密度试验结果良好.

表2 精密度试验结果Tab.2 Results of precision test

2.4 回收率试验

1) 本底值测定供试品溶液的制备.精密称取米诺膦酸约1.0 g，溶解并放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀释定容，振荡摇匀，即得.2) 回收率供试品溶液的制备.分别精密称取米诺膦酸6份，溶解并放置于10 mL量瓶中，加入1 mL的对照品母液，用N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀释定容，振荡摇匀，即得.3) 对照品溶液的制备.精密量取对照品母液1 mL，放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀释定容，振荡摇匀，即得.

分别精密量取对照品溶液、本底值测定供试品溶液和回收率供试品溶液各1 μL，进样，记录色谱图及峰面积，按照外标法计算测得量.计算样品的回收率，结果如表3所示.表3中：m1为加入量；m2为测定量；η为回收率；DRS为相对标准偏差.从表3可知：本品的回收率试验结果良好.

表3 回收率试验结果Tab.3 Recovery test results

2.5 小试3批样品的残留溶剂测定

根据人用药物注册技术要求，以及国际协调会(ICH)[15]和《中华人民共和国药典： 四部(2020年版)》[16]中甲醇的限量不超过0.3%，乙醇的限量不超过0.5%，二氯甲烷的限量不超过0.06%，甲苯的限量不超过0.089%.按照色谱条件对本品3批小试样品进行溶剂残留测定，如表4所示.从表4可知：3批小试样品中均未检出4种残留溶剂，表明小试3批样品的上述溶剂残留均符合规定.

表4 小试3批样品残留溶剂测定结果Tab.4 Determination results of residual solvent in 3 batches of small test samples

2.6 溶剂选择

为了精确检测米诺膦酸原料药中残留溶剂的含量，需选择一种合适的溶剂，既能完全溶解米诺膦酸又可完全溶解有机溶剂.因此，对二甲基亚砜、水、氢氧化钠溶液、N，N-二甲基甲酰胺等溶剂进行考察，结果显示米诺膦酸在二甲基亚砜中几乎不溶，在水中微溶，在氢氧化钠溶液中易溶，在N，N-二甲基甲酰胺中溶解.然而，由于碱性溶液直接进样会污染内衬管，容易损坏色谱柱，且米诺膦酸在N，N-二甲基甲酰胺溶液中回收率能达到95%以上.因此，文中选择N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂进行实验.

2.7 进样方式选择

根据《中华人民共和国药典： 四部(2020年版)》[16]中残留溶剂测试方法，选择直接进样法.溶液直接进样法无需前处理过程，简单快速、精密度高，且重复性好.实验过程中测定4种有机溶剂的检测限，乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯的检测限分别为0.029，0.052，0.051，0.051 ng.结果表明，该方法检测限低，灵敏度高，因此可选择溶液直接进样法进行实验.

2.8 色谱柱选择

(a) DB-1701色谱柱

(b) DB-1301色谱柱 (c) DB-624色谱柱图2 不同毛细管色谱柱的GC图谱Fig.2 GC spectra of different capillary columns

DB-1701毛细管色谱柱是一款(14% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色谱柱，DB-1301 毛细管色谱柱与DB-1701毛细管色谱柱类似，是一款(6% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色谱柱，二者均具有较低至中等极性；DB-624毛细管色谱柱则是一款高惰性色谱柱，该色谱柱可用于快速 GC/MS分析，专门为了分析挥发性物质和残留溶剂而设计的，对活性化合物具备优良的惰性.3种色谱柱均经过键合交联，均可使用溶剂冲洗.

采用进样混合溶液，分别考察安捷伦DB-624，DB-1701，DB-1301等3种毛细管色谱柱的分离效果，结果如图2所示.由图2可知：采用安捷伦DB-1701色谱柱得到的色谱图峰型差、灵敏度低；采用DB-1301色谱柱得到的色谱图峰型较好，但灵敏度同样较低；采用安捷伦DB-624色谱柱分离得到的峰型较好，且灵敏度高、出峰时间短、分离度好.因此，选用安捷伦DB-624色谱柱作为实验色谱柱.

3 结束语

实验建立了米诺膦酸中乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4种残留溶剂的含量测定方法.该方法精密度好、准确度高，可为米诺膦酸原料药及米诺膦酸片剂的质量控制提供参考依据.通过对3批米诺膦酸原料药的小试样品进行残留溶剂的检测，结果表明，3批米诺膦酸原料药中均未检出乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4种残留溶剂，符合《中华人民共和国药典： 四部(2020年版)》[16]的原料药质量要求.接下来的研究将会测试采集到的车间生产样品，进一步考察该方法的实际可行性和适用性.