影响茉莉H病毒沉默抑制子功能关键氨基酸的鉴定

朱丽娟, 张崇涛, 王耀伟, 江朝杨, 解晓盈, 白雅妮, 韩艳红

(1.福建农林大学植物保护学院；2.福建农林大学媒介病毒研究中心；3.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

茉莉H病毒(JasminevirusH, JaVH)是一种给茉莉生产造成重大经济损失的病害[1].JaVH属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)天竺葵黄斑病毒属(Pelarspovirus)，是一种正单链RNA病毒，基因组全长3 867 nts，含有5个开放阅读框(open reading frame, ORF):ORF1编码辅助复制相关蛋白，ORF2通读ORF1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)，ORF3和ORF4编码2个运动蛋白(movement protein, MP)，ORF5编码外壳蛋白(coat protein, CP)[1].在病毒与寄主的长期竞争中，寄主会形成多种抗病毒机制，其中RNA沉默是寄主抵御病毒入侵的关键手段[2].为了抵抗寄主的RNA沉默，病毒会表达一种或几种RNA沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing, VSR)，以增强自身致病能力[3].越来越多的研究表明,CP不仅包裹病毒核酸，还能作为VSR发挥作用[4-7].为明确JaVH CP是否具有VSR功能，本研究构建JaVH CP瞬时表达重组质粒pXT-CP，利用农杆菌共浸润瞬时表达系统鉴定其功能；同时,构建多个pXT-CP突变体，探究影响JaVH CP功能的关键氨基酸位点，以期为解析JaVH致病的分子机理提供依据.

1 材料与方法

1.1 植物材料

本生烟(Nicotianabenthamiana)种子由福建农林大学媒介病毒研究中心实验室(以下简称本实验室)保存.植物培养条件：温度(24±1)℃，光照16 h，黑暗8 h，湿度50%.

1.2 载体与菌株

pGDG由美国加州大学伯克利分校Andrew O Jackson教授惠赠，pXT载体由南京农业大学陶小荣教授惠赠，含JaVH全长的质粒pTOPO-JaVH-FJ及中间载体质粒pTOPO-JaVH-FJ-H(1 405～3 867 bp)由本实验室前期构建，大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109和农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101均由本实验室制备、保存.

1.3 试剂与引物

高保真酶Phusion®High-Fidelity PCR Kit和限制性内切酶购自NEB公司，胶回收和质粒提取试剂盒购自Transgen公司，T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司.本研究所用的引物见表1.

表1 本试验所用引物

1.4 瞬时表达质粒pXT-CP的构建

以含有JaVH-FJ基因组全长的质粒pTOPO-JaVH-FJ为模板，用引物2622F/CPR-Bam经PCR扩增CP片段全长，扩增产物经BamHⅠ酶切后利用试剂盒回收、纯化，将纯化产物与经StuⅠ和BamHⅠ线性化的pXT载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，然后涂布于具有卡那霉素抗性的平板上，37 ℃烘箱培养过夜.用枪头随机挑取平板上的单菌落，在另一个含有相同抗性的固体LB平板上划线，将划完线的枪头放入PCR管中作为模板进行PCR检测，筛选阳性克隆送至福建博尚生物技术有限公司测序.

1.5 pXT-CP多种突变体的构建

将JaVH CP氨基酸序列与同属其他病毒进行比对分析，发现多个较保守的氨基酸残基，参考已报道能影响沉默抑制子功能的关键氨基酸位点[8-11]，在JaVH CP氨基酸序列比对中筛选出可能相关的18个候选突变位点.以pTOPO-JaVH-FJ-H为模板，用相对应的引物(表1)进行反向PCR扩增，扩增产物中加入DpnⅠ去除质粒模板，然后用T4 PNK将片段进行磷酸化，再用T4 DNA连接酶16 ℃连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，PCR筛选阳性菌落，经测序获得正确的重组突变质粒pTOPO-M(M代表相应突变体).然后，以pTOPO-M质粒为模板，用引物(2622F/CPR-Bam)扩增获得对应突变的CP片段，扩增产物经BamHⅠ酶切后胶回收、纯化，分别将其与经StuⅠ和BamHⅠ线性化的pXT载体连接，菌落经PCR鉴定获得各个阳性重组质粒pXT-CP-M.

1.6 农杆菌共浸润瞬时表达系统的建立

农杆菌共浸润表达系统是一种被广泛应用的快速鉴定VSR的方法[12-13]，该方法一般需要2个农杆菌质粒：一个用来诱发RNA沉默，通常含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)报告基因;另一个用来表达待测基因.将这2个质粒转化农杆菌后混合浸润植物叶片，再跟踪观察浸润区域的荧光表达情况.3 d后，如果浸润待测基因的叶片区域比浸润空载体对照区域的荧光强，则认为该基因编码一个VSR[14].基因瞬时表达量一般在24～48 h表达量最高，之后会逐渐被寄主沉默直至消失，但当同时表达VSR时，可以不同程度地抑制寄主沉默，延长基因表达的时间.

将获取的重组质粒pXT-CP、pXT-CP-M分别转化农杆菌GV3101，菌落经PCR筛选阳性克隆，随后将阳性菌落接种至1 mL含卡那霉素和利福平抗性的液体LB中，并放入28 ℃摇床培养过夜，次日将菌液按1∶100接种于额外含有MES/As的液体LB中，28 ℃培养至D600 nm为0.6.离心5 min(室温，4 000 r·min-1)收集菌体，用悬浮缓冲液调至D600 nm为0.8，重悬至少3～4 h后用于侵染.将待测基因pXT-CP、pXT-CP-M分别和pGDG共浸润本生烟，以pGDG+pXT混合浸润为阴性对照，将其认为是空载体(empty vector, EV)，pGDG+P19TBSV混合侵染为阳性对照，跟踪观察浸润区域的荧光表达情况.

1.7 利用Western blot检测CP和GFP的表达量

采集浸润第5天的突变体、阳性以及阴性对照的本生烟叶片，提取其总蛋白并与等体积2×SDS上样缓冲液混匀后100 ℃变性10 min，上样于SDS-PAGE胶电泳，用半干转膜法[15]将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，转移完毕的膜经TBS-T缓冲液漂洗后，转入适量的封闭液(TBS-T并含3% BSA)中，37 ℃封闭至少1 h.弃封闭液，加入适量的特异性抗血清(TBS-T稀释)，37 ℃反应至少1 h，TBS-T缓冲液漂洗膜3次，然后加入用TBS-T稀释的AP-A，37 ℃反应30～60 min，TBS-T漂洗3次，显色观察CP和GFP表达量.

2 结果与分析

2.1 pXT-CP重组质粒的获得

以质粒pTOPO-JaVH-FJ为模板扩增获得大小约1 000 bp的CP基因片段.将该片段经BamHⅠ酶切后利用试剂盒进行纯化，然后将其与经StuⅠ和BamHⅠ线性化的pXT载体连接，菌落经PCR筛选阳性克隆后测序，结果表明pXT-CP重组质粒构建成功.

2.2 JaVH CP VSR功能的鉴定

将pGDG与含有pXT-CP质粒的农杆菌共浸润本生烟，以pGDG+pXT为阴性对照，pGDG+P19TBSV为阳性对照，利用长波紫外灯(Black Ray Model B 100AP/R)持续观察浸润区域的荧光表达情况.浸润第2天，pGDG+pXT、pGDG+P19TBSV和pGDG+pXT-CP均表达高亮度的绿色荧光，表明瞬时表达均被启动；第5天，浸润pGDG+pXT的区域几乎没有荧光，而pGDG+pXT-CP和pGDG+P19TBSV均表达高亮度的绿色荧光(图1).阴性对照由于没有抑制子的存在，随时间的推移，绿色荧光蛋白逐渐被寄主沉默；阳性对照P19TBSV是一个强RNA沉默抑制子，抑制了寄主的沉默，从而维持了高亮度的绿色荧光.CP的表现与阳性对照接近，表明JaVH CP是一个具有较强RNA沉默功能的抑制子.

EV(左上)：pGDG+pXT；P19TBSV(左下)：pGDG+P19TBSV；CP(右下)：pGDG+pXT-CP.

2.3 JaVH CP氨基酸分析

将JaVH CP氨基酸序列与同属其他病毒进行比对，发现存在多个较保守的氨基酸残基，参考已报道影响沉默抑制子功能的氨基酸位点[8-11]，筛选出候选位点进行功能鉴定，具体如图2所示.

红色框：候选氨基酸位点，红框下方氨基酸为突变后的残基.CLCMV(Clematis chlorotic mottle virus)：铁线莲斑点病毒;ELV(Elderberry latent virus)：接骨木潜隐病毒;PCRPV(Pelargonium chlorotic ring pattern virus)：天竺葵褪绿环型病毒;PelRSV(Pelargonium ring spot virus)：天竺葵环斑病毒;PLPV(Pelargonium line pattern virus)：天竺葵线型病毒;RrLDV(Rosa rugosa leaf distortion virus)：玫瑰叶畸形病毒;RYLV(Rose yellow leaf virus)：玫瑰黄叶病毒.

2.4 pXT-CP突变体的获得及功能验证

以中间载体pTOPO-JaVH-FJ-M质粒为模板，用相对应的引物进行反向PCR扩增，获得大小约为4 300 bp的片段，T4连接后测序，结果表明成功获得突变重组质粒.以测序正确的突变重组质粒为模板，经2622F/CPR-Bam引物扩增获得大小约1 000 bp的CP突变片段，BamHⅠ酶切后回收，与经StuⅠ和BamHⅠ线性化的pXT载体连接，菌落经PCR筛选后测序，结果表明重组质粒pXT-CP-M构建成功.分别将各个阳性pXT-CP-M质粒转化农杆菌GV3101，并与转化pGDG的GV3101混合浸润本生烟，以pGDG+pXT作为阴性对照，pGDG+P19TBSV和pGDG+pXT-CP为阳性对照，浸润第5天，利用紫外灯观察并拍摄记录所有突变体浸润区域的荧光表达情况(图3).根据荧光结果，可以将突变体分为2类：与阳性对照pGDG+pXT-CP有较一致的荧光强度(K36A和P112N)，这些位点基本不影响VSR功能；与阴性对照接近(W28A、R40A、R58A、G75R、G75A、IT83-84RS、IT83-84AA、I83A、T84A、V108A、F111A、S115A、K123A、Y124A、R132A和K200A)，观察不到明显绿色荧光，表明这些氨基酸残基为影响VSR功能的位点.因此，初步确定Trp 28、Arg 40、Arg 58、Gly 75、Ile 83、Thr 84、Val 108、Phe 111、Ser 115、Lys 123、Tyr 124、Arg 132和Lys 200可能影响JAVH CP VSR功能.

EV(左上)：pGDG+pXT；P19TBSV(左下)：pGDG+P19TBSV；CP(右上):pGDG+pXT-CP；突变体(右下)：pGDG+pXT-CP-M.

2.5 Western blot检测

利用Western blot进一步确定2.4中获得的13个CP关键氨基酸位点，检测共浸润5 d的突变体、阳性以及阴性对照的CP和GFP表达量.结果表明，这13个关键氨基酸对应突变体的CP和GFP表达量均远低于阳性对照，而与阴性对照较接近(图4).该结果与2.4的荧光观察结果一致，证明这些氨基酸位点是影响CP VSR功能的关键位点.

图4 Western blot检测GFP和JaVH CP在浸润区的表达(浸润5 d)

为了排除因为CP自身未表达而导致突变体VSR功能为阴性的可能，选取部分上述检测中未表现VSR功能的突变体(W28A、R40A、G75A、IT83-84AA、V108A、R132A)，提取共浸润2 d的叶片总蛋白，通过Western blot检测CP是否表达，结果发现无论是CP还是CP突变体中都有蛋白的高表达(图5).因此，可排除VSR功能呈阴性是由于CP被突变后本身不表达的可能.

图5 Western blot检测JaVH CP在浸润区的表达(浸润2 d)

3 讨论

研究表明，天竺葵黄斑病毒属病毒的CP除了参与形成病毒粒子作用外，还具有抑制RNA沉默的功能[16].为了研究JaVH的CP是否具有类似的功能，本研究构建了JaVH CP瞬时表达重组质粒pXT-CP，并利用农杆菌共浸润瞬时表达系统证明其具有VSR功能，该结果与同属的代表种天竺葵线型病毒的表现[17]相一致；同时，构建了pXT-CP的突变体，利用共浸润瞬时表达系统，比较了突变体与pXT-CP的荧光表达情况，最终确定影响CP VSR功能的关键氨基酸位点包括Trp 28、Arg 40、Arg 58、Gly 75、Ile 83、Thr 84、Val 108、Phe 111、Ser 115、Lys 123、Tyr 124、Arg 132和Lys 200.通过关键氨基酸位点的研究，可能揭示关键位点与致病性的关联.因为植物自身的RNA干扰(RNA interference, RNAi)作用，瞬时表达的蛋白在植物体内的存在时间有限.本研究显示，在早期(侵染2 d)无论是CP还是CP的突变体都有很高的表达量，说明CP的所有突变体都能正常表达且表达量没有显著差异.侵染第5天，CP突变体以及用作指示的GFP蛋白都出现不同程度的减少，说明CP突变体的RNAi抑制作用变弱或缺失，但不排除存在其他抑制CP蛋白降解的可能，该机制值得进一步探究.