甘蔗栽培种WRKY基因家族鉴定及其在黑穗病菌胁迫下的表达分析

王东姣, 张 畅, 阙蓓蓓, 尤垂淮, 罗 俊, 苏亚春

(1.福建农林大学农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室；2.福建农林大学教育部作物遗传育种与综合利用重点实验室；3.福建农林大学国际学院；4.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

植物在生长发育过程中受到逆境胁迫时会在植物体内形成复杂的防御调控网络，转录因子在此期间起着重要的调节作用[1].WRKY转录因子作为植物转录调节因子中最大的家族之一，在植物抗逆性方面具有重要功能[2].由60个氨基酸组成的WRKY结构域是WRKY转录因子典型的结构域[3].在某些WRKY蛋白中，WRKY结构域的氨基酸序列已被WRRY、WKRY、WSKY、WVKY或WKKY替换[4].WRKY结构域的特征是在N端具有一个高度保守的核心WRKYGQK基序和位于C端的由CX4-5CX22-23HX1H或CX7CX7-23HX1C组成的锌指结构[5].根据WRKY结构域的数目和类型，WRKY转录因子可分为3类[6].第Ⅰ类：WRKY转录因子具有2个WRKY域.第Ⅱ或第Ⅲ类：WRKY转录因子具有1个WRKY域.第Ⅰ、Ⅱ类的WRKY成员所具有的锌指结构为C2H2(CX4-5CX22-23HX1H)，其中X可以是任何氨基酸.第Ⅲ类的WRKY蛋白所含的锌指结构为C2HC(CX7CX23HXC)[5].根据各成员之间的同源性，第Ⅱ类WRKY家族又可以分为Ⅱa～Ⅱe等5个亚类[7].Dong et al[8]则将拟南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY家族的第Ⅱ类分为Ⅱa～Ⅱg等7个亚类.

首个甘薯(Ipomoeabatatas)WRKY转录因子被克隆后[9]，在其他100多个植物物种中相继鉴定出WRKY基因家族.Guo et al[10]在葡萄(Vitisvinifera)中鉴定到59个VvWRKY基因，其在不同组织中的表达模式有所不同，且55个VvWRKY基因对至少一种非生物胁迫处理有不同程度的响应，38个VvWRKY基因在白粉病(Erysiphenecator)感染后差异表达.Chanwala et al[11]在珍珠粟(Pennisetumamericarum)中共鉴定出97个PgWRKY蛋白，并将其分为三大类(Ⅰ～Ⅲ)，PgWRKY基因家族成员分布在7条染色体上，其基因启动子区存在多种顺式调控元件.由此可见，WRKY转录因子广泛参与植物的生长发育和逆境应答过程.甘蔗(Saccharumspp.)是重要的糖料作物和能源作物[12].甘蔗近缘野生种割手密(Saccharumspontaneum)为现代栽培杂交种提供了病虫害和逆境相关的抗性基因，约占了甘蔗杂交种基因组的15%，其四倍体基因组被组装到了32条染色体上[13].Li et al[13]在割手密基因组中鉴定到154个SsWRKY基因家族成员，RNA-seq分析发现SsWRKY在46个不同发育阶段的样品中显示出不同的时间和空间表达模式，其中，52个SsWRKY基因在所有组织中表达，4个SsWRKY基因未在任何组织中表达，21个SsWRKY基因可能参与光合作用.甘蔗栽培种(Saccharumspp.hybrid)R570拥有迄今为止较为完整的甘蔗栽培种基因组信息，该品种具有广泛的适应性，在世界多个育种站被用作亲本，同时在留尼旺、毛里求斯和瓜德罗普岛商业化种植[14].R570基因组约为115条染色体，其中,10%染色体来自割手密，10%染色体来自割手密与热带种(Saccharumspontaneum)的重组染色体，其余来自于热带种染色体[14].目前，在甘蔗上已有关于WRKY基因的研究报道(Sc-WRKY[15]、ScWRKY3[16]、ScWRKY4[17]、ScWRKY5[18]和ScWRKY6[19])，但有关甘蔗栽培种WRKY基因家族的鉴定尚未见报道.

甘蔗黑穗病是由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisoriumscitamineum)引起的一种真菌病害，随着宿根年限的延长危害逐年加重，制约了甘蔗产业的健康发展[20].本研究基于甘蔗栽培种R570基因组[14]挖掘和鉴定了甘蔗ShWRKY家族转录因子，分析了其染色体分布、系统发育、理化性质、基因结构、保守基序、基因上游启动子顺式作用元件以及在不同甘蔗组织和黑穗病菌胁迫下的基因表达模式，并利用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)技术检测了候选ShWRKY基因在不同甘蔗基因型与黑穗病菌互作下的表达水平，旨在了解甘蔗栽培种WRKY基因家族成员的序列特征和表达特性，为进一步的WRKY基因克隆及其抗病功能解析提供依据.

1 材料与方法

1.1 甘蔗栽培种ShWRKY基因家族的鉴定

甘蔗栽培种R570的基因组数据从Sugarcane Genome Hub(https://sugarcane-genome.cirad.fr/)[14]下载.通过在线网站Pfam数据库[21]下载隐马尔科夫模型(hidden markov model, HMM)WRKY DBD(PF03106)的HMM模型[22]，用来识别R570基因组序列中的WRKY序列.去重复后，利用Conserved Domain Database[23]网站查看WRKY的假定保守结构域，进行WRKY保守结构域的鉴定、筛选.

1.2 ShWRKY基因家族的染色体定位分析

从R570基因组数据库[14]中下载序列GFF3文件，获得WRKY基因长度信息以及位置信息，然后使用MapGene2Chrom(MG2C)软件对ShWRKY基因染色体定位实现可视化，染色体颜色设置为绿色，其余参数为默认参数.

1.3 ShWRKY蛋白的系统进化分析

用MUSCLE v3.7[24]进行蛋白序列比对，采用PhyloSuite[25]软件中的IQ-TREE构建ShWRKY蛋白与水稻(Oryzasativa)OsWRKY蛋白[26]的系统发育进化树，设置重复值为1 000次.借助EvolView[27]在线网站对进化树进行美化.

1.4 ShWRKY蛋白的多序列比对、理化性质和亚细胞定位分析

通过DNAMAN软件进行ShWRKY蛋白的多序列比对.采用ExPASy的ProtParam[28]进行ShWRKY蛋白理化性质预测，包括编码氨基酸个数、分子量、等电点、不稳定系数、脂肪系数和平均疏水性.利用Euk-mPLoc 2.0.[29]在线网站预测ShWRKY蛋白的亚细胞定位.

1.5 ShWRKY基因家族的保守基序和基因结构分析

通过MEME在线网站[30]分析获得ShWRKY基因家族的保守基序信息，参数设置显示10个保守基序，其余为默认参数.ShWRKY基因家族的外显子—内含子结构信息从甘蔗栽培种R570基因组GFF3文件中获取.使用TBtools[31]软件实现ShWRKY的保守基序和基因结构的可视化.

1.6 ShWRKY基因家族启动子顺式作用元件的查找与功能预测

基于甘蔗栽培种R570基因组数据库[14]，调取ShWRKY基因家族启动子前2 000 bp序列.利用PlantCARE在线网站[32]对ShWRKY基因家族上游启动子顺式作用元件进行功能预测，并用TBtools[31]软件对其进行可视化.

1.7 ShWRKY基因家族在不同甘蔗组织和黑穗病菌胁迫下的表达模式分析

分别基于构建的甘蔗主要栽培种ROC22成熟期的不同组织(蔗皮、蔗肉、根、叶和芽)的转录组数据库以及甘蔗黑穗病感病品种ROC22和甘蔗黑穗病抗病品种YC05-179接种黑穗病菌后不同时间(0、1、2和5 d)的转录组数据库[20]，调取WRKY转录本信息，并与鉴定到的R570数据库中的ShWRKY基因家族进行序列比对，选取序列相似度在90%以上的ShWRKY基因进行组织表达模式分析和黑穗病菌胁迫下的表达模式分析.ShWRKY基因的转录丰度以FPKM(fragements per kilobase of transcript per million mapped)值作为分析指标，并利用TBtools[31]软件绘制热图.

1.8 实时荧光定量(RT-qPCR)分析

甘蔗品种包括2个抗黑穗病甘蔗品种(YT96-86和YZ03-258)和2个感黑穗病甘蔗品种(YZ03-103和FN40)，由农业农村部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供.选取10个月龄的健康且长势一致的甘蔗茎段，在32 ℃催芽培养，当芽萌发至1～2 cm后，处理组用5×106个·mL-1(含0.01%吐温-20)的黑穗病菌混合孢子悬浮液针刺接种蔗芽；对照组接种无菌水[20].然后，将处理组和对照组置28 ℃、16 h(光照)/8 h(黑暗)培养.分别于接种0、1、3和7 d后收集5个单芽，液氮冻存后，-80 ℃冰箱储存.

利用Trizol法提取样品RNA，按照PrimeScript RT Reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书合成第一链cDNA，以10倍稀释液作为RT-qPCR模板.利用primer5软件设计两个候选ShWRKY基因ShWRKY37和ShWRKY51的特异性定量引物ShWRKY37-Q-F/R(5′-GTGAAGAGGACCATCAGAGTGCC-3′和5′-TGTAGTAGCCCCGTGGGTAAGG-3′)和ShWRKY51-Q-F/R(5′-CGGCTACAAGTGGAGGAAGT-3′和5′-TGTGGTGTTCTTGGTGGATAG-3′).内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GeneBank登录号为CA254672)，引物为GAPDH-Q-F/R(5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′和5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3′).利用ABI 7500 Real-time PCR System(美国)进行RT-qPCR检测，按照SYBR Green PCR Master Mix Kit 说明书进行RT-qPCR扩增程序和反应体系配置，用2-ΔΔCt方法计算定量数据[33].

2 结果与分析

2.1 甘蔗栽培种ShWRKY基因家族的鉴定

在甘蔗栽培种R570基因组数据库中筛选具有完整结构域的WRKY序列，最终获得60条ShWRKY基因，根据其在染色体上的位置，依次命名为ShWRKY1～ShWRKY60(表1).

表1 基于甘蔗栽培种R570基因组数据库鉴定获得的60条ShWRKY基因信息

2.2 ShWRKY基因家族的染色体定位

染色体定位结果显示，ShWRKY基因家族成员一共定位在10条R570染色体上，每条染色体分布3～13个ShWRKY基因(图1).3号染色体分布的ShWRKY基因数目最多，为13个.4号、6号和7号染色体分布的ShWRKY基因数目最少，均只有3个.其次，9号染色体分布9个ShWRKY基因，2号染色体分布8个ShWRKY基因，1号和8号染色体均分布6个ShWRKY基因，10号染色体分布5个ShWRKY基因，5号染色体分布4个ShWRKY基因.其中分布在2号染色体上的ShWRKY基因出现成簇聚集现象，即ShWRKY7～ShWRKY11基因聚集分布.从染色体定位情况来看，ShWRKY基因家族与其它物种的基因家族类似，存在基因成簇聚集，推测它们可能具有相似的功能.

染色体的数目显示在每条染色体的顶部.左边的比列尺代表染色体长度(Mb).

2.3 ShWRKY蛋白的系统进化分析

以水稻OsWRKY基因序列为参考，构建ShWRKY基因家族的系统发育进化树(图2)，结果显示ShWRKs共分为三大类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，第Ⅱ类又分为5个亚类(Ⅱa～Ⅱe).属于第Ⅰ类WRKY家族成员的有10个，第Ⅱ类有32个(Ⅱa类2个、Ⅱb类5个、Ⅱc类15个、Ⅱd类5个、Ⅱe类5个)，第Ⅲ类有18个.总的来说，ShWRKY基因家族中属于Ⅱ类和Ⅲ类的家族成员较多，属于Ⅰ类的家族成员相对较少.

ShWRKY：甘蔗栽培种R570 WRKY.OsWRKY：水稻WRKY.

2.4 ShWRKY蛋白的多序列比对、理化性质和亚细胞定位分析

ShWRKY蛋白多序列比对结果(图3)显示，Ⅰ类家族成员位于N末端的WRKY结构域均未发生变异，为WRKYGQK；Ⅱ类家族成员中Ⅱa、Ⅱb、Ⅱd、Ⅱe亚类的WRKY结构域均未发生变异，Ⅱc亚类中的ShWRKY4、ShWRKY17、ShWRKY47和ShWRKY51位于N末端的WRKY结构域发生变异，表现为WKKYGQK和WRKYGKK；Ⅲ类中的ShWRKY25、ShWRKY31、ShWRKY32、ShWRKY34和ShWRKY44的WRKY结构域均发生变异，表现为WKKYGQK和WRKYGEK，其位于C末端的锌指结构也与Ⅰ类和Ⅱ类家族成员有所不同，为CX7CX7-23HX1C，而Ⅰ类和Ⅱ类家族成员为CX7CX7-23HX1H.蛋白理化性质和亚细胞定位预测结果显示，60个ShWRKY序列编码氨基酸的个数为139～721，分子质量为15 163.74～76 738.43 u，等电点在7.0以下的有32个.除ShWRKY13蛋白为稳定的亲水性核定位蛋白，推测其余ShWRKY家族成员均为不稳定的亲水性核定位蛋白.

WRKY结构域WRKYGQK、WRKYGKK或者WKKYGQ用红色框线标注；锌指结构(CX4-5CX22-23HX1H和CX7CX7-23HX1C)用黑色框线标注；星号标注主要的结构域序列.

2.5 ShWRKY基因家族的保守基序和基因结构分析

基因结构分析结果(图4)显示，ShWRKY基因家族成员含有1～5个外显子，其中4个ShWRKY有1个外显子，15个ShWRKY有2个外显子，31个ShWRKY有3个外显子，6个ShWRKY有4个外显子，4个ShWRKY有5个外显子.进一步分析发现，属于同一分类的ShWRKY基因具有相似的外显子数目，如4个属于Ⅱe类的ShWRKY家族成员都有3个外显子.同时也存在属于同一类的ShWRKY家族成员含有的外显子数目不同，如属于Ⅰ类的ShWRKY家族成员含有的外显子数目为1～5个不等.该结果为ShWRKY基因家族成员的功能分化提供依据.

A：ShWRKY蛋白系统发育进化树；B：ShWRKY基因的内含子—外显子结构；C：ShWRKY蛋白保守基序分布.

利用MEME软件分析60个ShWRKY蛋白的保守基序，共查找了ShWRKY蛋白的10个保守基序.图4显示，ShWRKY基因家族的保守基序有3～7个，且属于家族同一类型的ShWRKY蛋白具有相似的保守基序.大多数ShWRKY家族成员都有Motif 1、Motif 2和Motif 3，其中Motif 1含有WRKYGQK序列.有一些保守基序为某个WRKY类别所特有，如只属于Ⅰ类ShWRKY家族成员的Motif 4，而Motif 8为Ⅱd类ShWRKY家族成员所特有，Motif 5、Motif 9和Motif 10为Ⅲ类ShWRKY家族成员所特有.结果表明保守基序在家族同一类型的ShWRKY中存在相似性，而在不同类型ShWRKY中存在多样性，推测特有的Motif可能在不同类型ShWRKY家族成员中发挥特定作用.

2.6 ShWRKY基因家族启动子顺式作用元件的功能分析

对ShWRKY基因家族上游前2 000 bp的启动子顺式作用元件功能进行预测，结果显示，多个顺式作用元件与胁迫、生长发育和激素响应相关(图5).其中，与胁迫相关的顺式作用元件包括干旱诱导元件(MBS)，低温响应元件(LTR)，干旱、低温、盐胁迫响应元件(DRE)和机械损伤响应元件(WUN-motif).生长发育相关元件包括厌氧诱导元件(ARE)、分生组织表达元件(CAT-box)、参与玉米醇溶蛋白代谢调控元件(O2-site)、种子特异性调控元件(RY-element)和参与胚乳表达的顺式调控元件(GCN4-motif).激素响应元件包括茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、生长素(auxin, IAA)响应元件(AuxRR-core和TGA-element)、脱落酸(abscisic acid, ABA)响应元件(ABRE)、赤霉素(gibberellin, GA)响应元件(GARE-motif和P-box)和水杨酸(salicylic acid, SA)响应元件(TCA-element).其中只有属于Ⅱd类的ShWRKY3和Ⅱc类的ShWRKY17包含参与干旱、低温、盐胁迫的响应元件DRE，属于Ⅲ类的ShWRKY31包含14个MeJA响应元件CGTCA-motif，属于Ⅱc类的ShWRKY53和ShWRKY54包含15个ABA响应元件ABRE.由此推测ShWRKY基因家族可能参与甘蔗生长发育和逆境应答进程.

A.ShWRKY蛋白系统发育进化树；B.ShWRKY基因启动子顺式作用元件分布；C.ShWRKY基因启动子顺式作用元件数目.不同颜色的盒子代表不同的顺式作用元件.

2.7 ShWRKY基因家族在不同甘蔗组织和黑穗病菌胁迫下的表达模式

通过比对甘蔗ROC22成熟期的组织转录组数据和同源性发现ShWRKY基因的表达存在组织特异性，且属于同一类型的ShWRKY基因在甘蔗不同组织中的表达模式存在差异(图6).其中，38个ShWRKY基因在5个甘蔗组织(蔗皮、蔗肉、根、叶和芽)中均有表达(log2FPKM>0)，2个ShWRKY基因(ShWRKY42和ShWRKY43)在5个甘蔗组织中均不表达.属于Ⅰ类的ShWRKY48、Ⅱc类的ShWRKY51、Ⅱd类的ShWRKY37、Ⅲ类的ShWRKY9和ShWRKY26在甘蔗5个组织中均高表达(log2FPKM>15)，26个ShWRKY基因在甘蔗组织中均低表达(log2FPKM<10).而Ⅱc类的ShWRKY22、Ⅱe类的ShWRKY23和Ⅱd类的ShWRKY37在芽中的表达量明显高于其它组织.

表达水平的变化从蓝色(低表达)到红色(高表达).SE：蔗皮；SP：蔗肉；R：根；L：叶；B：芽.

甘蔗受黑穗病菌侵染的转录组数据[20]分析结果(图7)显示，除ShWRKY34基因外，其余ShWRKYs基因均受黑穗病菌诱导表达，超过一半的ShWRKY基因(72%)在甘蔗黑穗病感病品种ROC22和抗病品种YC05-179中低表达(log2FPKM<10)，4个ShWRKY基因(ShWRKY23、ShWRKY37、ShWRKY48和ShWRKY51)在ROC22和YC05-179中高表达(log2FPKM>15).相比于0 d，随着接种黑穗病菌时间的延长(1～5 d)，Ⅰ类的ShWRKY12和ShWRKY48、Ⅱd类的ShWRKYs、Ⅱc类的ShWRKY51/53/54在两品种中总体呈上调表达趋势，Ⅱe类的ShWRKY23在感病品种中上调表达而在抗病品种中下调表达，其余ShWRKYs基因的表达丰度相对较低.

表达水平的变化从蓝色(低表达)到红色(高表达)，如图右上图的颜色梯度所示.基于log2 FPKM变化数据采用TBtools软件对黑穗病菌胁迫的响应进行了热图分析和分层聚类.ROC22-0 d、ROC22-1 d、ROC22-2 d和ROC22-5 d分别代表甘蔗感黑穗病病品种ROC22接种黑穗病菌0 d、1 d、2 d和5 d；YC05-179-0 d、YC05-179-1 d、YC05-179-2 d和YC05-179-5 d分别代表甘蔗抗黑穗病病品种崖城05-179接种黑穗病菌0 d、1 d、2 d和5 d.

2.8 候选ShWRKY基因在不同甘蔗品种与黑穗病菌互作下的表达

结合转录组数据，进一步挑选出两个在蔗芽组织高表达且受黑穗病菌诱导表达的Ⅱd类ShWRKY37和Ⅱc类ShWRKY51基因，利用RT-qPCR分析其在4个甘蔗品种与黑穗病菌互作下的表达情况(图8).结果(图8)显示，接种黑穗病菌7 d后，ShWRKY37基因在抗黑穗病甘蔗品种YT96-86、YZ03-258和感黑穗病甘蔗品种YZ03-103中的表达量均上调，分别为对照组的1.89、1.87和1.35倍；而在感黑穗病甘蔗品种FN40中的表达量显著下调，为对照组的0.19倍(图8A).ShWRKY51基因在抗黑穗病甘蔗品种YT96-86和YZ03-258接种黑穗病菌1～7 d后的表达量均呈下降趋势，而在感黑穗病甘蔗品种YZ03-103和FN40接种早期(1 d)中的表达量显著上升，分别为对照组的2.25和1.66倍，随后下调表达或恢复至对照水平(图8B).

A：ShWRKY37基因在甘蔗受黑穗病菌胁迫下的表达量.B：ShWRKY51基因在甘蔗受黑穗病菌胁迫下的表达量.YT96-86和YZ03-258：抗黑穗病甘蔗品种(R)；YZ03-103和FN40：感黑穗病甘蔗品种(S).实验数据以GAPDH的表达水平进行归一化处理.所有的数据点表示平均值±标准误(n=3).柱上不同的字母代表由新复极差法计算的显著性差异(P<0.05).

3 讨论

植物WRKY转录因子是一个大家族，关于WRKY基因家族的全基因组分析已在许多物种中广泛开展，如割手密[13]、油橄榄(Oleaeuropaea)[34]、菠萝[35]和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[36]等.本研究首次对甘蔗栽培种R570基因组中的ShWRKY基因家族进行挖掘，共鉴定出分布于10条染色体上的60个家族成员ShWRKY1～ShWRKY60(表1)，且在2号染色体上出现了基因簇(ShWRKY7～ShWRKY11)(图1).在水稻中，OsWRKY基因家族成员同样在染色体上成簇聚集[37].前人研究表明，基因聚集代表这些基因可能具有相似的结构和功能[38].以OsWRKY家族成员分类为参考，将ShWRKYs分为三大类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，属于Ⅱ类(32个)和Ⅲ类(18个)的较多，属于Ⅰ类(10个)的相对较少(图2).作为WRKY的进化祖先，Ⅰ类WRKY成员的功能不像Ⅱ类或Ⅲ类WRKY成员那样多样化[7].Ⅱ类WRKY在拟南芥中可通过调节抗病机制中的关键基因或蛋白来调控植物的抗病性[39].Wang et al[40]报道第Ⅲ类WRKY可以影响植物抗病能力，并在生物进化过程中，当遭受外界胁迫时可以促进植物的适应性[41].在水稻中，部分WRKY蛋白的氨基酸序列发生变异，突变为WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY[42].在本研究中，多重序列比对显示ShWRKY家族成员的WRKY结构域有WRKYGQK、WKKYGQK、WRKYGKK和WRKYGEK几种类型(图3).值得注意的是，WRKYGQK基序的变异主要出现在ShWRKY家族的Ⅱc亚类和Ⅲ类中，暗示Ⅱc亚类和Ⅲ类的WRKY基因可能具有多种生物学功能.外显子—内含子结构的多样化在许多基因家族的进化中起着重要的作用，不同染色体片段的重排和融合导致外显子—内含子的获得和丢失[10].外显子和内含子之间的结构差异也被认为是系统发育分组的有用工具，这种多样性是基因家族进化、多样化和新功能的重要组成部分[4,43,44].本研究中，属于同一类别或不同类别的ShWRKY家族成员的外显子—内含子数目存在差异，推测基因结构的不同会导致ShWRKY家族成员出现功能分化.基序的种类和数目是WRKY家族分类的重要依据[42].图4C显示，所有的ShWRKY都具有WRKY结构域，说明它们都属于WRKY家族成员，同一类别的ShWRKY家族成员大都有相似的motif种类和数目，而不同类别的ShWRKY家族成员所包含的motif种类和数目有所不同，推测ShWRKY基因可能因motif的种类和个数不同而具有不同的生物学功能.

WRKY转录因子本身具有的顺式作用元件在植物的胁迫反应中发挥重要作用[45].前人研究[46]报道，在响应青枯菌(Pseudomonassolanacearum)侵染以及高温胁迫下，辣椒(Capsicumannuum)CaWRKY40启动子中的DWE(Double-W box-element)被诱导表达并发挥作用；同时，DWE驱动下CaWRKY40的转录水平受到了CaWRKY40自身以及CaWRKY27和CaWRKY58等转录因子的调控.经MeJA处理后，对长春花(Catharanthusroseus)CrWRKY1启动子表达量进行分析，发现启动子区域在-230～-93 bp包含一个推定的MeJA响应元件，推测CrWRKY1启动子有可能被用来分离参与TIA通路调控的新的转录因子[47].许多研究[48,49]报道显示，WRKY对干旱、寒冷和盐碱等多种胁迫都有反应，这可能是由于上游基因特异性结合相应的顺式元件来调控WRKY基因的表达.本研究也发现ShWRKY基因家族上游启动子具有多个与胁迫、生长发育和激素响应相关的顺式作用元件(图5)，推测ShWRKY基因家族可能参与甘蔗生长发育和逆境应答进程.

Huang et al[50]研究发现10个SlWRKY基因几乎在番茄所有组织中均组成型表达.在割手密中，SsWRKY在46个不同发育阶段样本中的表达谱呈现出不同的时空模式，其中52个SsWRKY基因在所有组织中表达，4个SsWRKY基因在所有组织中不表达[13].ShWRKY基因家族成员在甘蔗中的表达同样具有组织特异性，如38个ShWRKY基因在5个甘蔗组织中均有表达，而2个ShWRKY基因在甘蔗组织中不表达(图6).WRKY转录因子在植物先天免疫系统的两个分支即触发免疫(triggered immunity, PTI)和效应触发免疫(effector-triggered immunity, ETI)中发挥重要作用[51].在苹果(Malusdomestica)中，超过一半(119个中的63个)的MdWRKY基因对赤星病菌(Alternariaalternata)的侵染有响应[52].本研究中，72%的ShWRKY基因在感黑穗病品种ROC22和抗黑穗病品种YC05-179中低表达，4个ShWRKY基因在两品种中高表达(图7).Liuet al[15]发现甘蔗Ⅱc类Sc-WRKY基因在甘蔗品种FN22中能够被甘蔗黑穗病菌诱导表达.甘蔗Ⅱc类ScWRKY3基因的表达水平在感黑穗病甘蔗杂交种ROC22中下降，在抗黑穗病甘蔗杂交种YC05-179中保持不变[16].前人研究[53]表明，黑穗病菌主要通过蔗芽侵染蔗株.本研究中，ShWRKY22、ShWRKY23和ShWRKY37在芽中的表达量高于其它组织(图6)，推测这3个基因可能主要在芽中发挥功能.此外，受黑穗病菌侵染后，Ⅰ类的ShWRKY12和ShWRKY48、Ⅱc类的ShWRKY51/53/54和Ⅱd类的ShWRKYs在甘蔗抗病和感病品种中总体呈上调表达趋势，Ⅱe类的ShWRKY23在感病品种中上调表达而在抗病品种中下调表达，表明这些基因参与对黑穗病菌胁迫的响应过程.此外，ShWRKY37基因在2个甘蔗抗病品种和1个感病品种中上调表达，而在另外1个感病品种中下调表达，ShWRKY51则在抗病品种中下调表达，在感病品种应答早期(1 d)上调表达(图8).从进化树关系来看，与ShWRKY37同源性较高的OsWRKY68蛋白被报道可能通过下游的PR1b和PR10a在Xa21介导的水稻抵抗白叶枯病的途径中发挥作用[54].同样，ShWRKY37的同源蛋白OsWRKY7启动子在根和叶中的表达均受水稻白叶枯病菌[Xanthomonasoryzaepv.Oryzae(Xoo)]P10生理小种侵染的诱导，暗示其参与了水稻对白叶枯菌的防御反应[55].由此推测，ShWRKY37和ShWRKY51基因可能直接或间接的参与甘蔗对黑穗病菌的防御反应，两者有望作为候选基因用于进一步的抗病功能验证和分子机制解析研究.