巨大芽孢杆菌ω-转氨酶催化合成手性β-氨基醇

杨晓晓, 李 静, 张朝峰, 常宏宏, 张建栋

巨大芽孢杆菌-转氨酶催化合成手性-氨基醇

杨晓晓, 李 静, 张朝峰, 常宏宏, 张建栋

(太原理工大学 生物医学工程学院, 山西 太原 030024)

针对目前用于合成手性-氨基醇的()-转氨酶稀缺的问题，对来自巨大芽孢杆菌(SC6394)的 ()--转氨酶(BMTA)基因密码子进行优化，在大肠杆菌中成功表达，并对BMTA进行纯化表征。结果表明：BMTA对()--氨基醇具有较高活力，对()--氨基醇没有活力；BMTA在pH为7.5、温度为55 ℃下酶活最高，在pH为6.5～8.0，温度为4～30 ℃内具有较好的稳定性。应用BMTA对不同外消旋-氨基醇进行动力学拆分，底物转化率高达50%，对映体过量值(ee)为50%～99%。应用BMTA不对称还原胺化不同-羟基酮，产物()--氨基醇转化率高达58%～96%，ee>99%。

-转氨酶；手性-氨基醇；羟酮；动力学拆分；不对称还原胺化

1 前言

手性-氨基醇是一类非常重要的化合物，可以作为手性助剂或手性配体用于不对称催化反应[1-2]，也可作为手性中间体或砌块用于合成多种手性药物[3-4]。化学法合成手性-氨基醇[5-7]普遍存在合成工艺复杂、反应条件苛刻、选择性不高、催化剂昂贵等缺点。生物法作为一种绿色可持续方法[8]，已成为国际研究热点。目前，生物法合成手性-氨基醇主要包括转氨酶动力学拆分和不对称还原胺化[9]、脂肪酶动力学拆分[10]、胺脱氢酶不对称还原[11]、酮还原酶不对称还原[12]，以及级联生物催化环氧化物不对称开环等[13]。转氨酶作为一种高效催化剂在手性胺合成方面已经得到广泛应用[14]，但关于手性-氨基醇尤其是()--氨基醇合成的报道较少。目前仅有来自紫色色杆菌()的CVTA被报道可以还原胺化羟酮合成()--氨基醇，但产物转化率不到40%[15]。近年来，对来自河弧菌()[16]和鲁杰氏菌(TM1040)[17]的转氨酶(vfTA和3FCR)进行了定向进化，得到的突变酶被用于合成()--氨基醇，但反应效率仍有待提高。因此，筛选新的高活力高选择性转氨酶用于手性-氨基醇的合成具有重要的价值。

本研究对来自巨大芽孢杆菌(SC6394)[18]的一个()-转氨酶(BMTA)基因序列进行了密码子优化，在大肠杆菌(BL21)中进行了表达纯化及酶学性质表征；应用BMTA对外消旋-氨基醇进行了动力学拆分，得到()--氨基醇，同时考察了BMTA不对称还原胺化-羟基酮合成()--氨基醇的效率。

2 实验部分

2.1 材料与试剂

菌种与质粒：BL21感受态细胞购于天根生化公司，质粒pET-28a(+)购于安诺伦生物科技有限公司。

培养基(LB培养基)：质量浓度为10.0 g×L-1胰蛋白胨、5.0 g×L-1酵母提取物、10.0 g×L-1氯化钠(NaCl)，固体培养基添加质量浓度为15.0 g×L-1琼脂粉。

Terrific Broth培养基(TB培养基)：质量浓度为12.0 g×L-1胰蛋白胨、24.0 g×L-1酵母提取物、2.31 g×L-1磷酸二氢钾、12.54 g×L-1磷酸氢二钾、体积分数为4 mL×L-1甘油。其中涉及的试剂均为生化试剂级别，购于生工生物工程(上海)有限公司。

试剂：外消旋-氨基醇((±)-1)、()-1和()-1购于安耐吉化学有限公司和苏州爱玛特科技有限公司，-羟基酮(2)购于安耐吉化学有限公司和百灵威科技有限公司。本研究中所涉及的化学药品均为分析纯，其他化学试剂均可从市面上购买获得。

2.2 实验方法

2.2.1-转氨酶重组菌的构建

-转氨酶BMTA基因来自巨大芽孢杆菌(SC6394)，对BMTA基因密码子进行优化并交公司合成(通用生物公司)。将目的基因与表达载体pET28a连接，获得重组质粒pET28a-BMTA。将重组质粒pET28a-BMTA导入BL21感受态细胞中，获得重组(BMTA)。

2.2.2 BMTA在大肠杆菌中的表达及纯化

将(BMTA)接种于质量浓度为50 μg×mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，温度为37 ℃、转速为200 r×min-1培养7 h，取1 mL的培养液于50 mL的TB培养基(质量浓度为50 μg×mL-1的卡那霉素)中进行扩大培养。当培养液在波长为600 nm的吸光值(OD600)达到0.5～0.6时，向培养基中加入浓度为0.5 mmol×L-1的异丙基--D-硫代半乳糖苷(isopropy--D-thiogalactoside，IPTG)，20 ℃、200 r×min-1的条件下继续培养12～14 h，离心收集菌体，将菌体用磷酸缓冲液(浓度为100 mmol×L-1，pH=8.0)洗涤2次，最后用磷酸缓冲液将细胞悬浮，置于冰上，400 W下进行超声破碎10 min(工作时间4 s，间歇时间4 s)，将破碎液在温度为4 ℃、转速为3 000 r×min-1的条件下离心30 min，获得BMTA的粗酶液，通过镍柱进行纯化，SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。

2.2.3 BMTA的酶活力检测及酶活单位定义

1 mL反应液中有浓度为100 mmol×L-1磷酸钠缓冲液(pH=8.0)、10 mmol×L-1底物、10 mmol×L-1丙酮酸钠、0.2 mmol×L-15'-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5'-phosphate，PLP)和0.1 mL酶液，30 ℃反应10 min后，取样300 µL，NaCl饱和，加入10 µL氢氧化钠(浓度为10 mol×L-1)调节溶液pH>10.0，加入300 µL乙酸乙酯(含内标物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有机相加无水硫酸钠干燥后，气相检测生成-羟基酮的量。1 min内催化1 μmol产物生成所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用Bradford法测定酶液中蛋白质的浓度[19]。

2.2.4 pH和温度对BMTA酶活性的影响

在不同pH值的缓冲溶液中(磷酸钠缓冲液(100 mmol×L-1，pH为6.0～8.0)、Tris×HCl缓冲液(100 mmol×L-1，pH为8.0～9.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50 mmol×L-1，pH为9.0～10.0))测定BMTA对()-1c酶活。在最佳pH条件下，在不同温度(25～65 ℃)下检测BMTA对()-1c的酶活(参照2.2.3节)。

2.2.5 pH和温度对BMTA稳定性的影响

将BMTA置于2.2.4节不同pH的缓冲液中，于4 ℃下保存，不同时间取样检测该酶的残余酶活。将BMTA置于磷酸钠缓冲液(100 mmol×L-1，pH=7.5)中，分别在4～50 ℃的水浴中孵育，不同时间取样检测该酶的残余酶活(参照2.2.3节)。

2.2.6 BMTA动力学拆分外消旋-氨基醇

5 mL反应体系中有浓度为100 mmol×L-1磷酸钠缓冲液(pH=7.5)、5～20 mmol×L-1底物((±)-1a-l)、0.2 mmol×L-1PLP、5～20 mmol×L-1丙酮酸钠、质量浓度为10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的条件下反应12～24 h，取样300 µL，NaCl饱和，加入10 µL NaOH (10 mol×L-1)调节溶液pH>10.0，加入300 µL乙酸乙酯(含内标物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有机相加无水硫酸钠干燥后，气相检测生成-羟基酮的量以及底物的对映体过量百分数(electrical engineering, ee)，反应路线如图1所示。

图1 ω-转氨酶BMTA拆分外消旋β-氨基醇

2.2.7 BMTA不对称还原胺化-羟基酮

5 mL反应体系中有浓度为100 mmol×L-1磷酸钠缓冲液(pH=7.5)、10～20 mmol×L-1-羟基酮底物(2a-f)、0.2 mmol×L-1PLP、200～400 mmol×L-1L-丙氨酸、质量浓度为10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的条件下反应10～20 h，取样300 µL，NaCl饱和，加入10 µL NaOH(10 mol×L-1)调节溶液pH>10.0，加入300 µL乙酸乙酯(含内标物20 mmol×L-1十二烷)萃取，有机相加无水硫酸钠干燥后，气相检测生成-氨基醇的量以及产物的ee值，反应路线如图2所示。

图2 ω-转氨酶BMTA催化α-羟基酮不对称还原胺化

2.2.8 BMTA动力学拆分(±)-1c制备()-1c

100 mL反应体系中有浓度为100 mmol×L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.5)、20 mmol×L-1底物((±)-1c)、0.2 mmol×L-1PLP、20 mmol×L-1丙酮酸钠、质量浓度为10 mg×mL-1BMTA，在30 ℃、200 r×min-1的条件下反应24 h，反应液中加NaCl饱和，加入盐酸使溶液pH<2，100 mL乙酸乙酯连续萃取3次去除所提取的-羟基酮。加入NaOH溶液(10 mol×L-1)使溶液pH>10，100 mL乙酸乙酯重复萃取3次，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤后旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到的产物真空干燥过夜，计算产物得率。

2.2.9 分析方法

使用气相色谱分析转化率和ee值，具体方法按照Zhang等的方法进行[9]。

3 结果与讨论

3.1 BMTA的表达、纯化和酶活检测

如图3(a)所示，在蛋白质相对分子量r=53 000处出现与BMTA理论大小一致的目的条带，证明BMTA在大肠杆菌中成功表达，并且大多为可溶性表达(如图3(a)所示，lane 2)，仅产生少量包涵体蛋白(图3(a)，lane 3)。粗酶液经镍柱纯化后，得到单一的目的蛋白条带(图3(b)，lanes 7～8)。对纯酶酶活分析发现，BMTA对()-1c有较高酶活(1.1 U×mg-1)，对()-1c无活性。Nobili等[16]通过对来自的转氨酶vfTA进行蛋白质改造来提高其催化活力，对()-苯甘氨醇的催化活力仅为0.53 U×mg-1。BMTA作为一种()-选择性转氨酶，可立体选择性转化()--氨基醇，这一现象可用Cahn-Ingold-Prelog规则来解释[17]。

图3 ω-转氨酶BMTA表达及纯化的SDS-PAGE电泳图

3.2 pH对BMTA活性及稳定性的影响

如图4(a)所示，BMTA的最合适pH=7.5，当pH=6.5～8.0时，BMTA相对酶活稳定在80% 以上，当pH>8.5或者pH<6.5时，酶活迅速下降。如图4(b)所示，BMTA在pH=7.0的条件下较稳定，该条件下孵育24 h，残余酶活仍保持在74% 以上；在pH=7.5的条件下孵育24 h，残余酶活保持在65% 以上。当pH>8.5或pH<6.5时，BMTA酶活损失较大。BMTA在pH=7.0～8.0较稳定，而多数已报道的转氨酶的最适pH偏高，如Shin等[20]报道的来自JS17的转氨酶vfTA的最适pH=9.2，当pH>9.0时，酶稳定性迅速下降。

图4 pH对ω-转氨酶BMTA活性及稳定性的影响

3.3 温度对BMTA活性及稳定性的影响

如图5(a)所示，BMTA的最合适反应温度为55 ℃，高于60 ℃或低于50 ℃条件下，酶活迅速下降。BMTA温度稳定性结果如图5(b)所示，BMTA在温度为30 ℃下孵育24 h，残余酶活仍保持在50% 以上。在50 ℃下孵育9 h后酶活基本丧失，显示该酶在低于40 ℃温度下具有较好的稳定性。该结果与已报道的大多数转氨酶相似，如来自结核分枝杆菌()的()-转氨酶MVTA[9]，当温度高于40 ℃后，该酶酶活迅速下降。

图5 温度对ω-转氨酶BMTA活性及稳定性的影响

3.4 BMTA的底物特异性

BMTA对不同-氨基醇的酶活如表1所示，对链状-氨基醇()-1a的活性较低(0.152 U×mg-1)，而对含支链的链状-氨基醇()-1b活性较高(1.083 U×mg-1)；BMTA对含苯环-氨基醇()-1c的活性最高(1.107 U×mg-1)，对苯环对位含有卤素取代基的底物(()-1d-f)的活性呈下降趋势，为0.658～0.353 U×mg-1；BMTA对苯环对位含─CF3取代基的底物(()-1h)有较高活性(0.624 U×mg-1)；当底物的苯环间位被卤素取代后(()-1j-k)，BMTA的活性也呈现下降趋势，为0.758～0.346 U×mg-1。BMTA对所有()-底物(1a-l)没有活性，可见BMTA对-氨基醇具有极高的立体选择性。

表1 BMTA对不同底物的酶活性

3.5 BMTA动力学拆分外消旋β-氨基醇

如表2所示，BMTA对底物(±)-1a活性较低，反应24 h后，底物转化率仅有31.5%，ee值为50.1%；对其他底物(±)-1b-l，BMTA的活性较高，反应12～24 h，底物完全被拆分，底物转化率为50%左右，ee>98%。

表2 BMTA拆分外消旋β-氨基醇

3.6 BMTA不对称还原胺化α-羟基酮

如表3所示，BMTA对6种-羟基酮进行不对称还原胺化反应。反应10 h，底物2b-2d的转化率可达93% 以上，而底物2e转化率可达85.3%，产物ee>99%。进一步提高底物2c浓度至20 mmol×L-1，反应20 h，底物转化率仍可达95.2%。BMTA对2a和2f活力较低，反应10 h，转化率分别为58% 和60%。与BMTA相比，目前已报道转氨酶催化-羟基酮还原胺化活力普遍较低，如Nobili等[16]通过对来自的转氨酶vfTA进行蛋白质改造来提高其催化活力，但产物()-苯甘氨醇得率仅有60%。

表3 BMTA不对称还原胺化α-羟基酮

3.7 BMTA动力学拆分(±)-1c制备(S)-1c

在100 mL的反应体系中对20 mmol×L-1(±)-1c (275 mg)进行动力学拆分，反应24 h，转化率可达50%。经纯化后获得110.4 mg ()-1c，得率为40.2%，纯度>98%，ee>99%。

4 结论

对来自巨大芽孢杆菌(SC6394)的一个()-选择性-转氨酶BMTA基因密码子进行优化，并成功在大肠杆菌中进行高效表达，对酶进行了纯化和表征。研究发现，在温度为30 ℃、pH=7.5的条件下，且在PLP和丙酮酸钠存在时，BMTA可以拆分外消旋-氨基醇合成()--氨基醇；在30 ℃、pH=7.5的条件下，且在PLP和L-丙氨酸存在时，BMTA可不对称还原胺化-羟基酮合成()--氨基醇。此外，在100 mL的反应体系中对外消旋苯甘氨醇进行了动力学拆分，成功制备了()-1c，得率高达40.2%，ee>99%。本研究证明了BMTA对-氨基醇类化合物具有较高的活力和极好的立体选择性，对手性β-氨基醇类药物中间体工业化生产具有潜在的应用价值。

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Synthesis of chiral-amino alcohols by-transaminases from

YANG Xiao-xiao, LI Jing, ZHANG Chao-feng, CHANG Hong-hong, ZHANG Jian-dong

(College of Biomedical Engineering, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China)

()-transaminases available for chiral-amino alcohol synthesis are limited. A ()--transaminase (BMTA) gene (fromSC6394) codons was optimized and overexpressed in, and it was purified and characterized. The results show that the BMTA had high activity toward ()--amino alcohols, but no activity toward ()--amino alcohols. The maximum activity of BMTA was detected at pH 7.5 and 55 ℃, and it had good stability at pHs from 6.5 to 8.0 and temperatures from 4 ℃ to 30 ℃. Kinetic resolution of a set of racemic-amino alcohols by BMTA resulted in 50% conversion of substrates with 50%-99% ee of ()--amino alcohols. Asymmetric reductive amination of several-hydroxy ketones by BMTA resulted in 58%-96% conversions and >99% ee of ()--amino alcohols.

-transaminase; chiral-amino alcohols;-hydroxy ketones; kinetic resolution; asymmetric reduction amination

1003-9015(2021)06-1035-06

Q555.2

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.06.011

2020-10-16；

2020-12-29。

国家自然科学基金(21772141)；山西省青年基金 (201701D221042)。

杨晓晓(1996-)，女，山西临汾人，太原理工大学硕士生。

张建栋，E-mail：zhangjiandong@tyut.edu.cn