汉麻内生菌的分离及其抑菌活性研究

2022-01-17曹涤非薛佳莹黄国庆

现代农业科技 2022年1期

吴琼王雷曹涤非李瑶孙尧孙鑫薛佳莹黄国庆

（黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江哈尔滨 150020）

宿主植物种类及外在环境不同，植物内生菌种类和数量存在很大差异，因而内生菌菌种多种多样[1-2]。从汉麻中可以筛选出具有抑菌活性的内生菌，其会产生抗生素等活性成分，并且为了避免宿主植株死亡，这些抗生素活性成分毒性相对较低[3]。因此，开发汉麻内生菌，寻找新的抗生素，具有广阔的研究前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验试剂包括牛肉膏蛋白胨培养基；PDA培养基，由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；琼脂粉。

试验设备包括恒温培养箱、全自动立式高压灭菌器。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集。选择茂盛、无病虫害的汉麻植株，采集其新鲜的叶片、根、茎，每株采集3～4片叶片（无病虫害及斑点）。

1.2.2 样品预处理。采集得到的新鲜汉麻叶片用清水漂洗后切成0.3 cm×0.3 cm的组织块，将根、茎切成0.3 cm长的组织块，对组织块进行表面处理、表面干燥。

1.2.3 样品表面消毒。对预处理得到的样品进行表面消毒，方法如下：0.1%升汞漂洗10～30 s→无菌水冲洗数次→75%乙醇漂洗30～60 s→无菌水冲洗数次。检测表面消毒有效性：本试验需对检验材料组织表面消毒是否全面进行检测，设置2组对照试验。第1组：表面消毒完毕后，取最后一次清洗汉麻样品的无菌水涂布于平板培养基上，设置3个平行。第2组：将消毒后的汉麻样品置于平板培养基上，与培养基表面接触几分钟后取出，设置3个平行。将2组平板倒置于恒温培养箱（相同条件）中培养3 d，观察平板中是否长菌。无菌说明消毒彻底；有菌则表明消毒不彻底，需要重新进行样品预处理、表面消毒用于内生菌分离纯化。

1.2.4 汉麻内生菌分离纯化。在无菌操作条件下将组织块接种到PDA培养基中进行组织培养，每个平板接种4～5个组织块，共接种6个平板。将平板分成2组分别置于28℃及37℃恒温培养箱中培养3～7 d。观察到组织块长出菌落后，使用接种环挑取不同的菌落，采用划线法将菌落接种于平板培养基中进行分离培养。反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体在显微镜下观察，如无杂菌即可确定为纯种菌株。得到的纯种菌株分类接种于PDA斜面培养基中编号保藏。

1.2.5 汉麻内生菌发酵液上清液抑菌活性测定。菌株培养条件：温度设置为30℃，摇床转速150 r/min，用100 mL三角瓶装液30 mL，培养基的初始pH值设定为7.2。对发酵液上清液的抑菌活性进行测定采用的是菌丝平板生长抑制法[4-6]，方法如下：在无菌条件下操作，吸取2.5 mL菌株发酵液上清液置于培养皿中，取12.5 mL融化后冷却至40℃左右的PDA培养基加入培养皿中，混合均匀制成平板。对照以无菌水代替发酵液上清液。试验组及对照组均设3次重复。将供试病原菌菌丝块接入平板中央，30℃恒温培养。观察到对照培养皿中病原菌菌丝长满平板时，采用十字交叉法，用游标卡尺测量每个培养皿的病原菌菌落直径，计算抑菌率。计算方法如下：

抑菌率（%）=（对照菌落直径－样品菌落直径）/对照菌落直径×100

2 结果与分析

2.1 汉麻不同部位菌株种类

由表1可知，在64株汉麻内生菌中，15株来自汉麻根段、16株来自汉麻茎段、33株来自汉麻叶。结果表明，汉麻叶中的内生菌资源较丰富。

表1 汉麻不同部位内生菌分布情况

2.2 汉麻内生细菌对病原菌的抑制率

对17株汉麻内生细菌（3株来自汉麻根段、5株来自汉麻茎段、9株来自汉麻叶）的发酵液上清液进行抑菌活性检测，检测到8株有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制率不同（表2）。由表2可知，汉麻内生细菌中有抑菌活性的菌株比例较高且抑菌谱较广，对于供试细菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等均表现出一定的抑制作用。在8株有抑菌活性的汉麻内生细菌中，有6株来自汉麻叶片。