紫花苜蓿幼苗生物量无损估算

汪 辉，田浩琦，向 上，雷俊锋，周青平

(西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

自上世纪90年代初以来，基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等新学科在生命科学领域逐渐涌现并得到了快速发展.表型是由基因和环境共同作用的结果，通过表型组学研究获取多尺度、多生境、多源异构表型数据，可为研究基因型、环境因子和表型之间的联系提供有力依据，其与以上各组学相结合应用于复杂的系统生物学研究已成为热点[1].植物表型组学是基于基因组水平系统研究植物在不同生长环境下所有表型的学科，可为植物育种、栽培和生产的关键性状获取提供基于大数据的决策支持.在植物基因组学研究过程中，使用传统人工手段获取植物生物量、根系形态、叶部特征、产量组分特征等表型特征，因使用仪器多、检测速度慢、耗时费力、有损操作、环境条件等，成为制约作物功能研究的环节.1996年，Steven A. Garan提出了表型组学的概念，随后被用于作物生产中的资源产量估算[2-4]、根系表型测量[5]、病虫害防控[6-7]、养分丰缺诊断[8]、杂草识别[9-10]、抗逆性评价[11-12]、种子表型测量[13-14]等方面.数字图像技术的发展为开展植物表型组学研究提供有效途径.目前，可见光成像、近红外成像、多光谱成像技术、高光谱成像、热成像、荧光成像等二维成像技术以及激光雷达成像、计算机断层扫描成像磁共振成像等三维成像技术能够实现无损、连续、高效、自动、高通量采集植物表型特征[15-16].根据应用场景不同，以上成像技术可搭载传送式、轨道式、行走式、无人机等载体实现温室和田间植物表型特征数据采集.植物表型组学研究是突破未来作物学研究的关键领域，聚焦主要作物关键生产性状的高效筛选、监测、估算是实现高产栽培、保障食物供应的途径之一.

紫花苜蓿因其适应性强、牧草品质优，在全球范围内种植面积较大.建立快速、无损、高准确度的估算紫花苜蓿地上部分生物量的方法对于未来研究其表型特征、生长特性具有重要的价值.本研究选择国内外6个紫花苜蓿品种作为供试材料，通过使用表型分析仪拍摄其不同供水条件、不同生长阶段单个植株的顶视、侧视、正视二维RGB图像，旨在选择适宜参数，建立准确度较高的估算紫花苜蓿幼苗生物量的预测模型，以丰富牧草地上部分生物量评价方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选取6个国内外紫花苜蓿品种，供试种子来源见表1.

表1 供试紫花苜蓿品种种子来源

1.2 试验设计

2020年5月25日在西南民族大学四川省抗逆牧草种质创新及生态修复工程实验室植物培养室播种6个品种紫花苜蓿种子，5月30日出苗，出苗后15天分栽至塑料盆(直径15 cm，重0.075 kg)中，每盆一株，阿尔冈金和甘农5号每个品种20盆，其余品种每个品种12盆.每盆装营养土与蛭石1:1混合土0.325 kg，混合土原始含水量为33.8%.每天通过称重法补充各盆水量，每盆浇水至0.56 kg，出苗后第30天开始对阿尔冈金和甘农5号2个品种其中8盆进行干旱胁迫，每盆浇水至0.40 kg.出苗后第30、40、50天(分别缩写为30 d、40 d、50 d)使用Lab Scananlyzer表型分析仪(德国，LemnaTec GmbH)对紫花苜蓿植株进行拍照，每个处理重复4次.

1.3 指标测定

每次拍照后，使用卷尺量取每盆培养土面至植株自然垂直高度，记为株高；将每盆植株地上部分为茎部和叶部，分别称重，记为茎鲜重、叶鲜重；将茎部和叶部鲜样放入鼓风干燥箱中105 ℃杀青30 min，65 ℃烘至恒重，称量，记为茎干重、叶干重.

1.4 图片数据分析

采集每盆植株表型时，使用Lab Scananlyzer表型分析仪顶视相机和侧视相机拍摄照片，然后水平移动植株90°，再使用侧视相机拍摄照片，即为正视(图1).使用自带软件获取相应表型指标顶视面积、侧视面积、正视面积、最小外接圆直径，按照以下公式[17]计算绿色面积(Green area)，并使用每个最小外接圆直径值和绿色面积值分别除以其中最大值，求得相对最小外接圆直径和相对绿色面积(Relative green area).

图1 使用Lab Scananlyzer表型分析仪所拍摄的顶视、侧视和正视图片Fig. 1 Images taken using the top, side and front camera of the Lab Scananlyzer

绿色面积2=(顶视面积2+侧视面积2+正视2)

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1.5 数据处理

使用统计分析软件R(版本3.3.2)分析供试紫花苜蓿品种株高、茎鲜重、叶鲜重、总鲜重、茎干重、叶干重、总干重等指标的标准误差(SD)、最大值、最小值、平均值、变异系数(CV).使用Excel(版本2010)绘制株高与最小外接圆直径、总鲜重与相对绿色面积、总干重与相对绿色面积、预测总干重与总干重散点图及线性相关拟合直线.其中，使用WL343、阿尔冈金、甘农3号和甘农5号的茎鲜重、叶鲜重、总鲜重、茎干重、叶干重、总干重等指标与相对绿色面积训练线性模型，并使用WL319和驯鹿的数据验证所拟合的线性模型，并使用以下公式计算真实值与预测值拟合模型的决定系数R2、均方根误差(Root mean square error，RMSE)、相对误差(Relative error, RE).

(2)

(3)

(4)

2 结果分析

供试紫花苜蓿品种的叶干重、茎秆重和总干重具有较高变异，变异系数分别为54.887%、54.695%和52.844%，其中总干重为0.111～1.305 g/株(表2).株高的变异系数较低，为23.399%，株高为19.0～55.5 cm.

表2 株高及生物量统计分析描述

对6个紫花苜蓿品种3个生长阶段的株高与相对最小外接圆直径作线性相关分析，出苗后30、40、50天植株株高和总数据与相对最小外接圆直径相关系数分别为0.51、0.61、0.72和0.55，均达到显著水平(图2).

图2 株高与相对最小外接圆直径线性相关分析

叶鲜重、茎鲜重、总鲜重、叶干重、茎干重和总干重等生物量指标均与相对绿色面积有较强的线性相关关系，均达到极显著水平(表3).其中，相对绿色面积与出苗后30、40、50天和总数据的总鲜重的相关系数分别为0.79、0.92、0.83和0.88，与总干重的相关系数分别为0.69、0.86、0.82、0.84.

表3 生物量指标与相对绿色面积线性相关的相关系数

将6个品种中WL343、阿尔冈金、甘农3号和甘农5号等4个品种生物量指标数据用于建模，剩下的WL319和驯鹿的数据用于验证模型精度，并使用R2、RMSE和RE进行精度评定(表4).其中，相对绿色面积估算茎干重的模型精度最高，R2为0.82，RMSE为0.06 g，RE为25.2%.使用相对绿色面积估算总鲜重的模型R2为0.78，关系为y=4.4826x+0.6128；用于估算总干重的R2为0.75，关系为y=1.2184x+0.069(其中y为总鲜重或总干重，x为相对绿色面积，图3).实测总鲜重和总干重均分别与估算总鲜重和总干重之间具有较高一致性(图4).

表4 相对绿色面积预测生物量指标的线性模型验证Table 4 Validation of linear model for estimating biomass parameters using relative green area

图3 相对绿色面积预测总鲜重(A)和总干重(B)的线性模型

图4 总鲜重和总干重预测值与真实值比较

3 讨论

在分析植物功能生态和长势时，生物量是最为重要的指标之一，同时也是研究植物异速生长关系中的关键参数[18-19].地上部分生物量是在植物某一生育时期测定的所有地上部分的总重量.反复测量植物地上部分生物量是研究植物初级生产和生长速率的基本工作，尤其是在研究以收获营养枝为目的牧草生产过程中的一项重要工作.通常情况下，测定植物地上部分生物量是在确定留茬高度后，刈割并称量鲜重或者是使用烘箱烘干后测定干重.刈割、称量、烘干等过程需要花费大量的时间和人力，尤其是在研究植物生物量分布、适应性评价和异速生长时，需要测定大量植株个体数据[20].并且这种有损测量生物量的方法是无法实现监测同一植株个体的整个生长动态过程.本研究使用LabScananlyzer表型分析仪可实现连续、无损监测同一株紫花苜蓿植株的生长过程.

目前，已有一些研究报道了无损测定植物生物量的方法，例如使用植物表型分析仪拍摄数码照片并使用相应软件分析图片数据，计算叶面积、投影面积[21-23]或者单子叶植物的多边形面积[24-25]，最后估算植物生物量，该方法快速、精准、无损.本研究已证实，通过使用相机拍摄紫花苜蓿植株的RGB图像，获取植株的顶视面积、侧视面积、正视面积，计算得到的相对绿色面积与植株茎或者叶片的鲜重、干重之间存在显著的线性相关关系.同样，使用无损技术可以可靠的估算拟南芥[26]、烟草[27]、土豆[28]、麦类作物[29-30]和豌豆[17]的地上部分鲜重或者干重，且数字面积(Digital area)和地上部分生物量之间的相关程度较高.然而，植株叶片重叠、卷曲、皱缩以及旋转运动等现象会影响数字面积的准确测定，尤其是使用只具有一个相机的表型分析仪拍摄照片测定数字面积时，误差更大.当使用顶视相机获取植物照片估算拟南芥农艺性状时，无法应用到估算垂直生长相关的指标[23]，增加侧视相机可以解决该问题.Golzarian等[29]通过使用表型分析仪拍摄小麦和大麦植株正视、侧视和顶视二维图像，建立线性预测模型，可地上生物量能够得到准确预测盐胁迫下单个植株的地上部分生物量.本研究中使用的表型分析仪同时安装有顶视和侧视2个相机，可以降低系统误差，较准确地估算地上部生物量.

4 结论

使用Lab Scananlyzer表型分析仪拍摄紫花苜蓿幼苗不同生长阶段RGB图像，并从图像中提取的最小外接圆直径与幼苗株高之间呈现显著的正相关线性关系，从顶视、侧视和正视图像中提取绿色面积，经计算得到的相对绿色面积与茎或叶片鲜重及干重之间存在显著的正相关线性关系，可用于无损估算紫花苜蓿地上部分生物量.