长链非编码RNA牛磺酸上调基因在肝癌组织中表达及对肝癌细胞活性的影响

邵旭辉，丁希艳，李彦冬

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

长链非编码RNA(lncRNA)能够从多个分子水平调控基因表达，牛磺酸上调基因(TUG1)是近年来新发现的一种高度保守的lncRNA基因，在膀胱癌、食管癌细胞中高表达[1-2]，但目前仍缺少关于TUG1在肝癌中表达及作用的相关研究报道.国家癌症中心最新数据[3]显示：肝癌发病率位居全部恶性肿瘤的第5位，死亡率位居第2位，其发病机制仍未完全明确，探索相关分子机制对提高早期诊断率和改善临床预后具有重要意义.本研究探讨lncRNA TUG1在肝癌组织中的表达特点，并对肝癌细胞活性的影响和相关分子机制进行了研究，旨在为临床诊治提供新思路.

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本收集于2016年3月—2020年5月北华大学附属医院行手术治疗及肝脏穿刺确诊的肝细胞癌患者，取其对应的肿瘤组织、肿瘤边缘组织以及周边组织(无癌细胞组织)标本，另外一部分标本来源于既往实验剩余标本，共126例，应用原位杂交法检测TUG1表达情况.患者均签署知情同意书，且术前无放化疗史.其中，男78例，女48例；年龄52～76岁，平均(62.91±5.08)岁；肿瘤直径<5 cm 84例，≥5 cm 42例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期78例，Ⅲ～Ⅳ期48例；淋巴结转移52例；肿瘤分化程度：高分化81例，中低分化45例.新鲜标本组织切除后放入液氮中冻存.

1.2 主要材料与试剂

肝癌细胞株HCCLM3(武汉普诺赛生命科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640细胞培养基(Sigma公司，美国)；Transwell小室(南京迅贝生物有限公司)；质粒及通用型转染试剂Lipofectamine 3000(弗元(上海)生物科技有限公司)；qRT-PCR引物序列由北京百奥思科生物技术有限公司设计并合成；磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B一抗和相应的二抗(上海博湖生物有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 肝癌组织中lncRNA TUG1基因表达检测

应用原位杂交法检测lncRNA TUG1基因表达：组织标本切片后80 ℃烘干1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢浸泡，4%多聚甲醛固定.按原位杂交检测试剂盒说明书中的顺序依次加入RNA杂交液、生物素标记的探针进行杂交反应，以不含探针的预杂交液为阴性对照.使用全自动荧光原位杂交扫描分析系统读取lncRNA TUG1基因表达水平.

1.3.2 细胞培养转染及分组

HCCLM3细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育，观察HCCLM3细胞基本覆盖培育皿后，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞用于实验.将其分为3组：空白对照组(常规培养)、si-NC组(常规培养24 h后加终浓度100 nmol/L的空载体质粒)、si-TUG1组(常规培养24 h后加终浓度100 nmol/L的lncRNA TUG1表达抑制载体质粒).

1.3.3 qRT-PCR检测HCCLM3细胞中lncRNA TUG1基因表达水平

Trizol法提取空白对照组、si-NC组、si-TUG1组细胞总RNA，反转录得到cDNA后进行PCR扩增；TUG1引物序列：正义链5′-TGTCTTCAGAGCC GAACGTA-3′，反义链5′-GGTAAAATCGTTGCGTC TTCG-3′；GAPDH引物序列：正义链5′-ACAACTT CAGTCTCCTCTGGTCC-3′，反义链5′-GTAACGGGA GTTGCTGGTGGAG-3′.PCR反应条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，终延伸2 min，共40个循环.以GAPDH为内参计算相对表达量.

1.3.4 细胞迁移和侵袭能力检测

细胞迁移实验：将对数生长期空白对照组、si-NC组、si-TUG1组细胞用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，向Transwell小室的上室加入4×105个细胞，下室加入含胎牛血清的RPMI-1640培养基.在37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养24 h，弃去上室中的培养液，用磷酸缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定30 min，吸去上室中液体，结晶紫染色后显微镜下观察、拍照.

细胞侵袭实验：Matrigel基质胶与无胎牛血清的培养基按1∶7的比例混合，在Transwell小室上室与下室之间铺胶，按100 μL/孔均匀包被于小室底部膜，在37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中1 h成胶，其余步骤同细胞迁移实验.每组设置10个复孔.

1.3.5 Western blot检测细胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B蛋白表达

分别提取空白对照组、si-NC组、si-TUG1组细胞总蛋白，蛋白定量后电泳分离目标蛋白，湿法转膜后封闭；滴加兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶单克隆抗体、兔抗人蛋白激酶B单克隆抗体(1∶300)稀释；鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜；滴加HRP滴加二抗(1∶1 000稀释)，室温反应2 h；应用E-Gel Imager凝胶成像系统扫描并分析各条带灰度值.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 lncRNA TUG1在肝癌组织中的表达分析

qRT-PCR检测显示：lncRNA TUG1在肝癌组织中的相对表达量为1.86±0.29，明显高于癌旁正常组织中的相对表达量0.93±0.21，差异具有统计学意义(χ2=13.052，P=0.003).

2.2 肝癌组织中lncRNA TUG1基因表达与临床病理特征的关系

肝癌组织中lncRNA TUG1基因高表达率在不同年龄、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度的肺癌患者之间比较差异具有统计学意义(P<0.001).见表1.

表1 肝癌组织中lncRNA TUG1基因表达与临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between lncRNA TUG1 gene expression and clinic opathological features in hepatocellular carcinoma

2.3 各组肝癌细胞lncRNA TUG1基因表达水平

si-TUG1组肝癌细胞lncRNA TUG1基因相对表达量为0.95±0.17，明显低于si-NC组、空白对照组的肝癌细胞lncRNA TUG1基因相对表达量(1.84±0.21、1.89±0.25)，差异具有统计学意义(χ2=15.095、15.817，均P<0.001).

2.4 下调lncRNA TUG1基因表达对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

肝癌细胞迁移细胞数和侵袭细胞数在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.001)；其中si-TUG1组迁移细胞数和侵袭细胞数明显高于空白对照组、si-NC组，差异具有统计学意义(P<0.001).见图1、表2.

a.空白对照组迁移细胞；b.si-NC组迁移细胞；c.si-TUG1组迁移细胞；d.空白对照组侵袭细胞；e.si-NC组侵袭细胞；f.si-TUG1组侵袭细胞.图1 各组肝癌细胞迁移和侵袭情况(×200)Fig.1 Migration and invasion of hepatoma cells in each group(×200)

表2 各组肝癌细胞Transwell小室穿膜细胞数Tab.2 Number of transmembrane cells of liver cancer cells Transwell in each group

2.5 下调lncRNA TUG1对肝癌细胞磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B表达的影响

肝癌细胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表达量在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；其中si-TUG1组肝癌细胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表达量明显低于空白对照组、si-NC组，差异具有统计学意义(P<0.05).见图2、表3.

图2 各组肝癌细胞磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B表达的Western blot电泳Fig.2 Western blot electrophoresis of phosphatidy- linositol-3 kinase and protein kinase B expre- ssion of hepatoma cells in each group

表3 各组磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表达量Tab.3 Expression of phosphatidylinositol-3 kinase and protein kinase B in each group

3 讨 论

我国肝癌的发病率和死亡率高于全球平均水平，快速进展和高转移复发率是肝癌患者不良预后的主要原因[4].多种基因在恶性肿瘤的进展和转移中发挥促进作用，其中，lncRNA是近年来研究的热点之一.lncRNA是一类长度超过200个氨基酸的非编码RNA，在转录、翻译水平调控相关基因的表达，介导人体多种病理生理过程.目前，关于lncRNA在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌中表达及作用的研究较多[5-8]，也有少量关于lncRNA在肝癌中表达及作用的研究报道[9]，但不够全面，缺少关于lncRNA TUG1基因在肝癌中作用的系统研究.

lncRNA TUG1基因最先通过全基因组测序技术从小鼠肾脏细胞中筛选得到，之后发现在膀胱癌、食管癌细胞中高表达.本研究探讨了lncRNA TUG1基因在肝癌组织中的表达及与临床病理特征的关系，显示肝癌组织中lncRNA TUG1基因高表达率在不同年龄、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度的患者之间有明显差异.提示lncRNA TUG1基因在肝癌发生与进展中可能发挥促癌基因的作用，其表达水平与临床病理特征明显相关.进一步通过体外细胞学实验验证lncRNA TUG1基因表达对肝癌细胞的影响及相关分子机制，结果显示：下调肝癌细胞中lncRNA TUG1基因表达后细胞的迁移和侵袭能力明显减弱，提示lncRNA TUG1基因高表达与肝癌的发生、发展密切相关.

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路是一个经典的凋亡抑制信号传递通路，参与介导胃癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的发生与进展[10].磷脂酰肌醇-3激酶活化后能够激活下游的蛋白激酶B，活化后的蛋白激酶B能够介导下游多种凋亡基因的表达，导致凋亡相关基因失活，抑制肿瘤细胞凋亡[11].本研究结果显示：si-TUG1组肝癌细胞中磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B的表达量明显低于空白对照组、si-NC组.提示下调肝癌细胞中lncRNA TUG1基因表达能够抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路，进而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力.

综上所述，lncRNA TUG1基因在肝癌组织中高表达，且与患者的临床病理特征密切相关.抑制lncRNA TUG1基因表达能够降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与影响磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路有关.随着对lncRNA TUG1在肝癌中作用机制的深入研究，能够为肝癌的防治提供新的方向，其作为肝癌诊断的肿瘤标志物以及治疗的新靶点，有望提高肝癌的早期诊断率和预后水平.