肺栓塞患者血浆刺激HSP70和NOS表达的变化及意义

袁梦琪，李东富，龙春欢，杨慧君

(石家庄市人民医院，河北 石家庄 050035)

肺栓塞是因栓子堵塞肺动脉引发的病理生理性综合征，血管内皮细胞损伤与修复在病情发展中发挥关键作用[1].近年来，关于肺栓塞发病机制的研究主要着重于对血管内皮细胞损伤、修复的细胞学、分子生物学的探索[2].人脐静脉内皮细胞是源于脐带组织的干细胞，理论上能够无限制传递，参与人体正常的生理活动[3].一氧化氮(NO)作为血管舒张因子在抑制肺栓塞病情恶化过程中发挥重要作用，一氧化氮合酶(NOS)能够催化调节NO的生成[4].热休克蛋白70(HSP70)是具有多种生物学功能的活性物质，多种病理状态下HSP70均会出现改变[5].研究[6]显示：大鼠心肌组织中HSP70表达水平与NOS呈正相关.但关于肺栓塞患者血浆对引起血管内皮损伤的NO、cGMP因子表达的影响及在此过程中HSP70、NOS表达的作用仍未见系统研究报道.鉴于目前进行的血管内皮细胞实验多选用人脐静脉内皮细胞模型[7]，本研究利用人脐静脉内皮细胞模拟血管内皮细胞，探讨肺栓塞患者血浆对人脐静脉内皮细胞中HSP70和NOS表达的影响，对临床上判断肺栓塞患者病情发展具有实际意义.

1 材料与方法

1.1 材 料

人脐静脉内皮细胞(上海康朗生物科技有限公司)；肺栓塞患者血浆来自2018年5月—2019年10月石家庄市人民医院收治的152例肺栓塞患者，均经多层螺旋CT肺动脉造影和放射性核素肺通气/灌注显像确诊，发病14 d以内.其中，男85例，女67例；年龄52～76岁，平均(64.80±10.15)岁.健康人血浆来自同期体检的健康志愿者152例，男83例，女69例；年龄48～74岁，平均(64.07±9.83)岁.性别、年龄在肺栓塞患者、健康志愿者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性.

1.2 主要试剂

胎牛血清、DMEM培养基(武汉纯度生物科技有限公司)；RT-PCR检测试剂盒(天津生物芯片技术有限公司)；NO硝酸还原酶检测试剂盒、环磷酸鸟苷(cGMP)放射免疫检测试剂盒(上海科顺生物科技有限公司)；HSP70特异性抑制剂HSP70-IN-1(GipBio公司，美国)；免疫共沉淀试剂和所用抗体(上海爱必信生物有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 细胞培养与分组

将人脐静脉内皮细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置入37 ℃ 10% CO2培养箱中孵育，观察细胞生长，细胞约有80%汇合时进行分组(对照组、模型组、HSP70-IN-1干预组).在对照组中加入终浓度为20%的健康人血浆，模型组中加入终浓度为20%的肺栓塞患者血浆，HSP70-IN-1干预组中加入终浓度为20%的肺栓塞患者血浆和终浓度为10 μg/mL的HSP70-IN-1.

1.3.2 RT-PCR检测HSP70和NOS mRNA表达

分别于不同培养时间点(0、30、60、120、240 min)收集各组人脐静脉内皮细胞，提取RNA，操作步骤严格按照RT-PCR检测试剂盒说明进行.取扩增产物5 μL，行1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪进行灰度扫描，以β-actin为内参计算HSP70和NOS mRNA的相对表达量.PCR引物设计与合成由上海索宝生物有限公司完成.HSP70序列：上游引物5′-CCGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′，下游引物5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTAG-3′；NOS序列：上游引物5′-AAGAGGAGGTCGCGGGC GCC-3′，下游引物5′-CTGACTGATGGAGTACTTC TA-3′；β-actin序列：上游引物5′-CCGTCATTAGGCGGTCG GAA-3′，下游引物5′-CTCATGTAGTGGTCGTCGTA G-3′.

1.3.3 人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP浓度检测

取各组人脐静脉内皮细胞，37 ℃ 10% CO2培养箱中孵育2 h，弃去上清液；加入不含胎牛血清的DMEM培养基继续培养6 h，收集培养基上清液.使用硝酸还原酶检测试剂盒测定NO浓度，放射免疫检测试剂盒测定cGMP浓度，操作严格按试剂盒说明进行.

1.3.4 免疫共沉淀法检测HSP70与NOS相互作用

分别于不同培养时间点(0、30、60、120、240 min)收集各组人脐静脉内皮细胞，低温裂解细胞，4 ℃ 12 000 r/min恒温离心，收集上清液.将上清液分成两份，其中一份加入兔抗人HSP70多克隆抗体，另一份加入兔抗人NOS多克隆抗体，再分别加入蛋白A、琼脂糖4B悬液(1∶1)10 μL，4 ℃孵育3 h，3 000 r/min离心10 min，磷酸缓冲液洗涤后备用.分别取上述样品10 μL，行琼脂糖凝胶电泳，湿法转模至PVDF膜，分别滴加兔抗人HSP70多克隆抗体(1∶500稀释)，兔抗人NOS多克隆抗体(1∶300稀释)，4 ℃过夜.次日滴加山羊抗兔IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育2 h，ECL显色，凝胶成像系统拍照并分析灰度值.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组患者人脐静脉内皮细胞中HSP70和NOS mRNA的表达水平

在培养30～120 min时，人脐静脉内皮细胞中HSP70和NOS mRNA表达水平呈明显提升趋势，培养240 min时较培养120 min时有所下降.培养30～240 min时，HSP70-IN-1干预组人脐静脉内皮细胞中HSP70和NOS mRNA表达水平明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05).见表1.

表1 各组患者人脐静脉内皮细胞中HSP70和NOS mRNA的表达水平Tab.1 HSP70 and NOS mRNA expression levels of human umbilical vein endothelial cells in each group

2.2 各组人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP的含量

模型组与HSP70-IN-1干预组人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP含量明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；HSP70-IN-1干预组人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP含量明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05).见表2.

表2 各组人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP的含量Tab.2 NO and cGMP contents of the supernatant of human umbilical vein endothelial cell culture medium in each group

2.3 肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞中HSP70与NOS蛋白的相互作用

应用免疫共沉淀法检测肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞不同时间点HSP70与NOS蛋白的相互作用.分别使用兔抗人HSP70多克隆抗体、兔抗人NOS多克隆抗体沉淀蛋白复合体，电泳、转膜，再次用抗HSP70抗体、抗NOS抗体进行免疫识别.在相对分子量110 kD和153 kD位置出现特异性蛋白条带，提示HSP70与NOS存在相互作用.随着肺栓塞患者血浆处理时间的延长，脐静脉内皮细胞中HSP70与NOS蛋白表达水平均明显增加；HSP70与NOS蛋白表达水平在不同时间点之间比较差异均具有统计学意义(P<0.01).见图1、表3.

图1 人脐静脉内皮细胞不同时间点HSP70与NOS蛋白的相互作用Fig.1 Interaction between HSP70 and NOS protein in human umbilical vein endothelial cells

表3 人脐静脉内皮细胞不同时间点HSP70与NOS蛋白的表达水平Tab.3 HSP70 and NOS protein expression levels of human umbilical vein endothelial cells at diffe- rent time points

3 讨 论

相关研究[8]显示：血清HSP90在COPD患者中表达水平明显升高，且参与炎症调节作用.多种病理因素共同参与肺栓塞所致的肺组织小动脉收缩及相关低氧性损伤，其中HSP70表达是否增强目前仍未见相关研究报道.本研究结果显示：使用肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞后HSP70mRNA表达水平明显升高，使用HSP70特异性抑制剂HSP70-IN-1干预后HSP70 mRNA的表达水平明显下降，且上述表达呈明显的时间依赖性.提示肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞能够明显上调HSP70 mRNA的表达，且随着干预时间的延长表达水平逐渐升高；下调HSP70表达后，肺栓塞患者血浆对人脐静脉内皮细胞中HSP70 mRNA的表达影响明显减弱.HSP70是一类高度保守的蛋白，属于热休克蛋白家族，参与蛋白质折叠过程，是细胞中活跃的分子伴侣蛋白[9].当细胞受到外界环境刺激时HSP70表达水平明显增加，进而保护细胞免受应激损伤[10].HSP70不与底物活性肽作用时常处于ATP结合状态，其自身存在一定的ATP酶活性，短时间内不会出现自身水解[11].新生成的蛋白质在核糖体出现时，HSP70能够与疏水氨基酸残基序列相互结合，具有可逆性[12].当ATP水解生成ADP时，HSP70结合位点关闭，需要合成蛋白质时，核苷酸交换因子开放结合位点，诱发ADP释放，进而介导HSP70向HSP90转移[13].

研究[14]发现：在血流剪切力、雌激素等多种因素的作用下，诱发HSP70与NOS结合，改变NOS的构象可增强其催化活性.但在肺栓塞发生与发展过程中是否存在HSP70与NOS的相互作用仍未见相关研究报道.本研究结果显示：使用肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞后NOS mRNA的表达水平明显升高，使用HSP70特异性抑制剂HSP70-IN-1干预后NOS mRNA的表达水平明显下降，且上述表达呈明显的时间依赖性.提示肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞能够明显上调NOS mRNA表达，且随着干预时间的延长表达水平逐渐升高；下调NOS表达后，肺栓塞患者血浆对人脐静脉内皮细胞中NOS mRNA表达的影响明显减弱.NO作为舒血管因子，其合成与分泌主要依赖NOS，并参与调节血管平滑肌张力，在降低血管平滑肌收缩和增生、抑制血小板活性和炎症因子释放中发挥重要作用[15].NOS包括内皮型NOS、神经型NOS、诱导型NOS在内的3种同工酶，正常生理状态下，NO主要由结构型NOS合成与分泌，但在病理状态下，诱导型NOS表达上调会促进NO浓度增加[16].

人体合成的NO进入靶细胞后可激活鸟苷酸环化酶，促使cGMP浓度增加，临床上常通过测定cGMP浓度来反映NO水平.本研究结果显示：模型组与HSP70-IN-1干预组人脐静脉内皮细胞培养基上清液中NO、cGMP含量明显高于对照组，使用HSP70-IN-1干预后NO、cGMP含量明显降低，提示肺栓塞患者血浆刺激人脐静脉内皮细胞后NO水平明显升高.本研究采用免疫共沉淀法观察肺栓塞患者血浆处理人脐静脉内皮细胞后HSP70与NOS蛋白之间的相互作用，结果显示：HSP70与NOS存在相互作用，且随着肺栓塞患者血浆处理时间的延长，脐静脉内皮细胞中HSP70与NOS蛋白的表达水平也明显增加，HSP70特异性抑制剂HSP70-IN-1能够下调HSP70与NOS蛋白表达，提示HSP70与NOS存在相互作用关系，HSP70构象改变能够影响NOS对NO合成的调节作用.本研究应用肺栓塞患者血浆在体外作用于人脐静脉内皮细胞，探讨肺栓塞患者HSP70对NOS催化活性的影响，但血浆中存在多种刺激因子，在今后的研究中将进一步细化血浆中的刺激因子，探讨其对肺栓塞患者病情发展的影响.