薄壳山核桃煤污病病害调查及病原菌鉴定

陈雅琦，莫正海，娄文睿，翟 敏，郭忠仁，宣继萍

（江苏省中国科学院植物研究所 a.江苏省植物资源研究与利用重点实验室；b.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

薄壳山核桃Carya illinoinensis（Wangenh.）K.Koch又名美国山核桃、长山核桃，为胡桃科山核桃属落叶大乔木，原产于美国和墨西哥北部，喜温暖湿润气候，是优良的干果和木本油料树种[1-3]。近年来，国内的薄壳山核桃产业发展较快，江苏省内的南京、句容、泗洪等地已开始形成局部产业规模[4]。随着薄壳山核桃种植面积的不断扩大，危害薄壳山核桃的病害种类也不断增多。目前，我国已见报道的薄壳山核桃病害共计21种，其中已查明病原的病害有17种，未查明病原的病害有4种，煤污病为4种未查明病原的病害之一[5]。

煤污病对薄壳山核桃的危害极大，薄壳山核桃感染煤污病后其叶片、枝条的表面会产生大量灰色至灰黑色霉点甚至霉层，使得叶片正常的光合作用受到阻碍，进而影响树势、果实产量及品质[6]。为了解薄壳山核桃煤污病的发病率、感病指数及其与品种间的关系，明确煤污病的致病病菌，本研究调查了6个不同的薄壳山核桃品种，统计并计算其煤污病的发病率及感病指数；并以‘斯图尔特’染病叶片为病原菌提取材料，通过形态学观察及rDNA-ITS序列分析对煤污病病原菌进行鉴定，并采用柯赫氏法则加以验证，以期为薄壳山核桃抗煤污病品种的选择与煤污病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 薄壳山核桃煤污病病害调查

1.1.1 调查地点及调查对象概况

调查地点位于南京市六合区雄州街道龙虎营村的试验基地（118°53′17″E，32°18′24″N），为中纬度地区，属北亚热带季风气候区，四季分明，雨水充沛。1月的平均气温为2.2 ℃，7月的平均气温为27.9 ℃。

基地内种植的薄壳山核桃品种分别为‘波尼’‘金华’‘马罕’‘斯图尔特’‘绍兴’‘威奇塔’，于2013年春定植，种植密度为4 m×8 m。

1.1.2 煤污病病害的调查

每个薄壳山核桃品种随机调查3株，选取各样株树冠范围内离地面0～2 m高的小叶调查煤污病的发病状况，按下式计算其发病率，参考方中达[7]所用的分级计数标准并结合实际情况制定薄壳山核桃煤污病病情分级标准（表1）。

表1 薄壳山核桃煤污病感病指数分级标准Table 1 Classification standard for sooty mold disease index of pecan

1.2 薄壳山核桃煤污病病原菌的分离与鉴定

1.2.1 病原菌的分离纯化

使用无菌挑针轻轻刮取病叶上的霉层，将适量霉层粉末置于装有1 mL无菌水的离心管中，轻轻振荡制成孢子悬浮液。用酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却后蘸取孢子悬浮液，在PDA平板表面连续划线，于24 ℃的温度条件下进行黑暗培养以获得单菌落。挑取单菌落边缘的菌丝，再将其转移至新的PDA平板上培养以获得纯化菌株，并于25 ℃的温度条件下进行黑暗培养，分别于黑暗培养7、14、28 d时观察菌落的生长状态。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定

使用粘片法[8]对培养7、14或28 d后的病原菌分别进行形态学的鉴定：剪取小段透明胶，轻轻粘取菌丝或者孢子后将此小段透明胶置于滴有浮载剂的载玻片上，于显微镜下观察病原菌菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形状、颜色及大小。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定

使用OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取病原菌的DNA，选取通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）对 真 菌DNA的ITS片段进行扩增。反应体系为：50 μL，包含1 μL的DNA模板，25 μL的2×TSINGKE Master Mix（Blue），引物ITS1及ITS4各取1 μL（10 μmol/L），无菌超纯水22 μL。PCR的扩增程序为：首先在94 ℃的条件下进行5 min的预变性；然后在94 ℃的条件下变性30 s，在58 ℃的条件下退火30 s，在72 ℃的条件下延伸30 s，共计35个循环；最后在72 ℃的条件下进行10 min的终延伸。将PCR产物置于1%的琼脂糖中进行凝胶电泳检测，回收目的片段，然后将回收到的目的片段送往南京擎科生物科技有限公司进行测序。将测序所获得的序列置于NCBI网站中进行同源性Blast比对，随后下载相关真菌的ITS序列，再使用ClustalX 1.81软件进行多序列比对，采用MEGA X软件内置的邻位连接法（Neighbor-Joining Method，NJ）[9]进行系统发育树的构建（No.of Bootstrap Replications参数设为1 000，其余参数均为默认）。

1.2.4 病原菌致病性的验证

选择薄壳山核桃幼苗上的健康叶片为接种材料，使用无菌水清洗叶片后，将孢子悬浮液涂抹在叶片表面上[7]，以清洗后涂抹无菌水的叶片作为对照，在温度为25 ℃、湿度为95%的条件下进行12 h光照/12 h黑暗的交替培养。霉斑形成后，从接种部位再次分离病原菌，进行形态学及分子生物学鉴定，观察其是否与原接种病原菌相同。

2 结果与分析

2.1 薄壳山核桃不同品种的发病率和感病指数

薄壳山核桃煤污病主要发生在叶片和枝条上，不同病级的煤污病典型症状如图1所示。从图1中可以看出，感病指数最高的病级是V级。感染煤污病后叶片的上表面会形成黑色的霉层，而叶片的下表面并没有受到煤污病的危害。6个薄壳山核桃品种的发病率和感病指数见表2。由表2可知，6个薄壳山核桃品种的发病率从高到低依次为：‘绍兴’（66.79%）、‘斯图尔特’（61.98%）、‘威奇塔’（54.08%）、‘金华’（48.79%）、‘马罕’（27.17%）和‘波尼’（24.13%）。6个品种中，煤污病感病指数最高的是‘斯图尔特’，其感病指数为39.35；其次依次是‘绍兴’‘威奇塔’‘金华’，其感病指数分别为32.34、24.23、21.82；‘马罕’和‘波尼’的感病指数均较低，分别为14.12与11.07。调查数据显示，‘绍兴’的发病率最高，而其发病的严重程度稍低；‘斯图尔特’的发病率不如‘绍兴’，但其严重程度比‘绍兴’的高，且为6个品种中的最高者；‘威奇塔’‘金华’‘马罕’‘波尼’的发病率与感病指数的排名均一致。综合而言，‘斯图尔特’和‘绍兴’遭受煤污病危害的程度均较重，均为重度受害品种（其中，‘斯图尔特’的受害程度最大），‘威奇塔’和‘金华’均为中等受害品种，‘马罕’和‘波尼’为轻度受害品种。

表2 6个薄壳山核桃品种的发病率和感病指数†Table 2 Incidence and disease index of six pecan cultivars

图1 不同病级的薄壳山核桃煤污病的发病症状Fig.1 Symptoms of pecan sooty mold in different disease grades

2.2 薄壳山核桃煤污病病原菌的分离与鉴定结果

2.2.1 薄壳山核桃煤污病菌的形态学鉴定结果

经过多次分离纯化及显微观察，初步筛选得到了3种不同的煤污病菌，分别编号为B04、F03和G07，其在PDA培养基上的菌落形态如图2所示，3种煤污病病原菌的显微结构如图3所示。

观察发现，菌株B04在培养基上生长14 d后其菌落直径约为6 cm。从图2A中可以看出，菌落正面呈绒状，橄榄绿至深灰绿色，边缘菌丝白色，可见同心圆轮纹；菌落背面，绿褐色至墨绿色，边缘白色。显微镜下观察发现，该真菌分生孢子梗单生，直立，侧生或顶生，常具有隔膜，分隔处不收缩，淡褐色，光滑，具孢痕；分枝分生孢子呈圆柱形，无隔膜或具有1个隔膜，分枝分生孢子的大小为（12～23）×（3～4）μm；分生孢子多链生于分枝分生孢子顶部，椭圆形或柠檬形，分生孢子的大小通常为（3.5～8.0）×（2.5～4.0）μm（图3A）。该菌落的形态与有关文献[10-12]描述的枝孢属Cladosporium真菌的形态相似，据此可初步鉴定其为枝孢属某真菌。

图2 PDA培养基上3种煤污病病原菌的菌落形态Fig.2 Colony morphology of three pathogens of sooty mold on PDA

图3 3种煤污病病原菌的显微结构Fig.3 Microstructure of three pathogens of sooty mold

菌株F03在培养基上初为脏白色，菌落光滑粘稠，生长7 d后，其菌落直径还不到3 cm。菌落表面平展，呈油漆状，墨绿色至黑色，边缘呈根状（图2B）。显微镜下观察发现，该真菌菌丝深褐色，常断裂成小段，单个细胞呈砖型形，宽5.5～7.0 μm；分生孢子梗不明显；孢子透明、淡绿至深褐色，形态各异，单孢椭圆形，光滑，常为深褐色，单孢大小为（5.5～8.5）×（2.5～4.5）μm；双孢常呈葫芦形，两端钝圆，光滑，淡绿至深褐色，双孢的尺寸为（8.5～16）×（5.5～7.5）μm（图3B）。菌株F03的形态与有关文献[13-14]描述的短梗霉属Aureobacidium真菌的形态相似，据此可初步鉴定其为短梗霉属真菌。

菌株G07生长缓慢，培养基上生长28 d后其菌落直径还不到2 cm。菌落表面褶皱，中部隆起，深褐色至黑色，可见少量菌丝（图2C）。显微镜下观察发现，该真菌菌丝呈褐色，常由多根菌丝组合成束状而生长；分生孢子单生，褐色，光滑，具有分生孢子臂，使得整个孢子呈星状；分生孢子臂着生的基部细胞直径为2～3 μm，单个分生孢子具有3～4个分生孢子臂；每个分生孢子臂具有2～3个隔膜，隔膜处稍收缩，整臂长为16～20 μm，上窄下宽，近圆锥形，基部宽为6～7 μm，顶端宽为1～3 μm（图3C）。菌株G07的形态与有关文献[15-16]描述的多臂菌属Trichomerium真菌的形态相似，据此可初步鉴定其为多臂菌属真菌。

2.2.2 薄壳山核桃煤污病菌的分子生物学鉴定结果

提取病原菌核基因组DNA后，采用ITS1/ITS4引物进行ITS片段的PCR扩增。将纯化回收后的目的片段进行测序，然后利用NCBI网站将测序结果进行Blast比对，下载相关序列并构建系统发育树。分析结果表明，病原菌B04的ITS序列与枝状枝孢C.cladosporioides（LC515108.1）的序列的相似性较高，以ITS序列构建系统发育树，结果如图4所示。由图4可知，病原菌B04与枝状枝孢C.cladosporioides可聚为一类。结合形态特征鉴定结果分析，可将煤污病菌株B04鉴定为枝状枝孢C.cladosporioides。

图4 菌株B04的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain B04

病原菌F03的ITS序列与出芽短梗霉A.pullulans的序列（DQ309591.1）的相似性较高，以ITS序列构建其系统发育树，结果如图5所示。由图5可知，病原菌F03与出芽短梗霉A.pullulans可聚为一类。结合形态特征鉴定结果分析，可将煤污病菌株F03鉴定为出芽短梗霉A.pullulans。

图5 菌株F03的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of strain F03

病原菌G07的ITS序列与薯蓣多臂菌T.dioscoreae的序列（NR137946.1）的相似性较高，以ITS序列构建其系统发育树，结果如图6所示。图6表明，病原菌G07与薯蓣多臂菌T.dioscoreae可聚为一类。结合形态特征鉴定结果分析，可将煤污病菌株G07鉴定为薯蓣多臂菌T.dioscoreae。

图6 菌株G07的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain G07

2.2.3 病原菌致病性的测定结果

为了验证病原菌的致病性，本研究将纯化的菌株B04、F03及G07分别接种至薄壳山核桃叶片上，接种后观察发现，叶片表面形成灰黑色霉斑，且菌株B04形成霉斑的速度最快，其次依次是菌株F03与G07，而对照叶片未产生霉斑。观察从发病部位重新分离培养得到的菌株发现，其与接种前所用纯化菌株一致，这表明枝状枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蓣多臂菌T.dioscoreae均可导致薄壳山核桃煤污病的发生。

3 讨 论

煤污病病原菌的孢子或者菌丝体碎片通常借助雨水或气流进行传播。当孢子或者菌丝在含有蜜露的基质上萌发后，煤污病病原菌会在植株表面上生长。发病初期，植株体表可产生黑色烟煤状物质或覆盖绒毛状物，随后霉斑扩大并连接成片，最终形成霉层布满整个叶片、嫩枝及果实；发病后期，部分由病原菌造成的烟煤状物上会形成子囊壳、分生孢子器等结构，越冬后成为第2年的初侵染来源，并可造成多次的再侵染[6,17]。煤污病发病盛期分别为每年的3—6月和9—11月，其发病高峰期往往和蚜虫、蚧壳虫和粉虱等刺吸式害虫的危害盛期一致[18]。有关大麦[19]、赤楠[20]、文冠果[21]等植物煤污病的研究结果均表明，煤污病的发生与蚜虫相伴相生。蚜虫在摄取植物汁液中的水分和可溶性碳水化合物的同时，分泌出大量的粘性蜜露附着在叶片表面，这些富含营养物质的蜜露成为霉菌的培养基，从而诱导煤污病的发生[22]。已有研究结果表明，在薄壳山核桃中，煤污病的发生同样是由于蚜虫分泌的蜜露造成的[23]。而蜜露不易附着于叶片的下表面，这可能是薄壳山核桃煤污病主要危害叶片上表面的原因。研究中发现，薄壳山核桃不同品种遭受煤污病危害的程度有所不同，其中一个很重要的原因可能是，不同品种的叶片表面形态结构存在差异[24]。‘斯图尔特’与‘绍兴’的叶片表面均较粗糙，这使得蜜露易附着在叶片表面上；而‘马罕’与‘波尼’的叶片表面均较光滑，蜜露不易附着在叶片表面上。叶片附着蜜露能力的差异性可能导致了不同品种遭受煤污病危害的程度不同。

煤污病病原菌种类丰富，可以组成不同的群落致使植物发病，且不同地区主要流行的煤污病病原菌群落也存在差异。姜广正等[25]调查发现：北京、天津、烟台和南京地区的一些植物上煤污菌的群落组合均较简单，仅限于出芽短梗霉A.pullulans、枝孢属Cladosporium、链格孢属Alternaria这3个种群；而杭州和青岛等地区一些植物上煤污菌的群落组合不但比较复杂，而且出现了少见的种群，如麦提多绺孢Tripospermum mytti。研究中发现，薄壳山核桃煤污病病原菌由枝状枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蓣多臂菌T.dioscoreae组成，其中的枝状枝孢C.cladosporioides与出芽短梗霉A.pullulans均属于南京地区常见的煤污病病原菌种群，而薯蓣多臂菌T.dioscoreae模式种是日本学者从薯蓣叶片上分离得到的[16]，在我国云南及陕西的芒果、山楂树上均被发现，其可导致煤污病的发生[15]。目前，南京地区此前未有过该病原菌的相关报道，其原因可能是，该病原菌的存在可能与供试薄壳山核桃的生长环境有关（采样地点位于南京六合区农村，地处灵岩山山脚下），人类的采集行为或者野生动物的活动使得病原菌的传播范围从山上扩大到山脚下，同时生长在薄壳山核桃附近的植物中也可能存在提供侵染来源的储存寄主[15,26]。

枝状枝孢C.cladosporioides是一种常见的腐生菌，具有单孢型的分生孢子梗，孢子梗不会膨大，产生孢子后也不再延长，其上产生的分枝分生孢子上又会产生体小而数量多的链状分生孢子，在外力作用下极易分散，直接观察材料时容易被忽略，但人工培养时则极易获得[10,27]。观察发现，该病原菌分离得到的孢子数量多，菌丝生长速度快，并且极易在叶片上形成霉斑，这种生长优势可能是其成为薄壳山核桃煤污病主要致病菌的重要原因。

出芽短梗霉A.pullulans是一种类酵母真菌，不同的环境条件可导致其形态的改变，细胞常呈菌丝状或酵母状，可形成节孢子、芽分生孢子、厚垣孢子等[14]。出芽短梗霉A.pullulans的分布范围广，植物体、石灰岩及海洋中都可分离到此真菌，其具有很高的渗透压耐受性，同时其分泌的胞外多糖具有黏性，使得该真菌极易黏附在物体表面上[28]。该真菌的易于附着于物体表面的特点，可能是导致薄壳山核桃煤污病发生的一个重要原因。周小燕等[27]认为，散播烟霉Fumago vagans是柑橘煤污病的优势病原菌之一；而陆家云[13]与李荣禧等[29]则认为，煤污病病原菌之一的散播烟霉Fumago vagans实质上为出芽短梗霉A.pullulans、枝孢Cladosporiumspp.、链格孢Alternariasp.这三者或者前两者的混合体。在对薄壳山核桃煤污病病原菌进行初步分离时发现，出芽短梗霉A.pullulans与枝状枝孢C.cladosporioides常一起生长，这可能是由出芽短梗霉A.pullulans分泌的胞外多糖的物理黏附作用所致，而非代谢产物间的相互影响所致[25]。

多臂菌Trichomeriumspp.原属于座囊菌纲Dothideomycetes煤炱目Capnodiales的真菌，后来被归到散囊菌纲Eurotiomycetes刺盾炱目Chaetothyriales中[30]，该类真菌菌丝多分支，常勾连成束状、网状，在叶表面生长[15]，本研究中分离得到的薯蓣多臂菌T.dioscoreae在培养基上及叶片上生长的形态与该属真菌菌丝的生长形态一致，其复杂立体的结构使得该病原菌不易被水流和气流冲走，菌丝间的空隙为其它煤污病病原菌的附着及生长提供了有利的条件，从而导致病害的发生。

煤污病的分布范围广，危害的植物种类多，且菌落组成成分复杂，是一种常见的病害，而有关此病害的研究报道却少。目前，有关煤污病的研究内容主要集中在病原菌的分离鉴定、危害及防治等方面。本研究分离鉴定了3种薄壳山核桃煤污病的病原菌，但对这3种病原菌的组成比例却未作研究，不同品种的薄壳山核桃间其病原菌的组成比例是否有变化，对此问题仍待研究。薄壳山核桃在煤污病胁迫下其自身的生理生化变化及生长与抗病反应间的权衡，也是下一步研究的重点。

4 结 论

综上所述，不同薄壳山核桃品种的发病率和感病指数存在差异，煤污病对‘斯图尔特’和‘绍兴’的危害最严重，对‘威奇塔’和‘金华’的危害程度中等，对‘马罕’和‘波尼’的危害最轻。枝状枝孢C.cladosporioides、出芽短梗霉A.pullulans和薯蓣多臂菌T.dioscoreae均可导致薄壳山核桃煤污病的发生。