共表达H7N9 M2 蛋白和H5N1 HA 蛋白的流感病毒样颗粒的制备

张风卫 王珊珊 周红娟 商学钗 蔡龙

浙江大学医学院附属杭州市胸科医院临床医学检验实验中心 310003

近年来， 流感病毒跨物种感染成为流感防疫工作面临的新挑战，对人类健康造成重大影响[1-2]。接种疫苗是目前预防流感发生与传播的最有效方法，但由于流感病毒表面蛋白易发生抗原漂移、重配，变异的流感病毒极易逃避免疫系统记忆，导致疫苗失效[3]，因此研制一种能够应对流感病毒快速变异的广谱疫苗迫在眉睫。 近年来，以M2 蛋白为基础的广谱疫苗逐渐成为研究的热点[4-8]。M2 蛋白在所有A 型流感病毒中非常保守， 可诱导产生CTL，在反应中具有交叉保护能力，其作为流感广谱疫苗的成分进行研究具有潜在的意义和应用前景。 本研究拟利用基因工程技术，将禽流感H7N9流感病毒特异性抗原M2 蛋白作为基础蛋白，与高致病性禽流感H5N1 亚型膜蛋白HA 共表达，制备一种新型流感相关病毒样颗粒（VLPs），为广谱疫苗研究提供参考。

材料与方法

一、材料

昆虫细胞Sf9 及培养基、大肠埃希菌DH10Bac、转移载体 pFastDual、 杆粒转染试剂 Cellfectin ⅡReagent 和转染试剂 LipofectamineTM2000 购自Invitrogen 公司； 含 H5N1 的 HA 编码序列的质粒pVRC-H5N1 HA 由浙江大学医学院附属杭州市胸科医院临床医学检验实验中心保存； 含H7N9 M2基因的A 型流感病毒H7N9 M2 质粒购自北京义翘神州科技有限公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1， 限制性 内 切 酶 EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、Kpn Ⅰ 、Xho Ⅰ 购 自TAKARA 公司； 质粒提取试剂盒购自TIANGEN 公司； 杆粒提取试剂盒购自碧云天公司； 引物由Invitrogen 公司合成。

二、研究方法

1.重组穿梭载体的构建

重组穿梭载体pFastBac Dual-H5N1 HA 的构建：设计引物，引物序列：F：5'-CCGGAATTCATGGA GAAAATAGTGCTTCT-3'，R：5'-ACCAAGCTTTTA AATGCAAATTCTGCATT-3'， 以 pVRC-H5N1 HA 质粒为模板，PCR 扩增 HA 基因， 将 HA 基因克隆至pFastDual 的EcoRⅠ、HindⅢ位点之问，得到重组穿梭载体pFastBac Dual-H5N1 HA。

重组穿梭载体pFastDual-H5N1 HA-H7 M2 的构建：设计引物，引物序列：F：5'-CCGCTCGAGATG AGTCTTCTAACCGAGGT-3'，R：5'-CGGGGTACCT TACTTCAGCTCTATGTTGA-3'， 以 A 型流 感 病 毒H7N9 M2 质粒为模板，PCR 扩增 H7N9 M2（H7 M2）基因， 将M2 基因克隆在载体pFastBac Dual p10 启动子下的XhoⅠ、KpnⅠ位点之间，即得到重组穿梭质粒pFastBac Dual-H5N1 HA-H7 M2。

2. 重组杆状病毒表达质粒的构建及鉴定

转座构建重组杆状病毒质粒DNA H5N1 HAH7 M2 Bacmid： 参照 Invitrogen 公司的 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统技术手册，将构建好的穿梭载体pFastBac Dual-H5N1 HA-H7 M2、pFastBac Dual 空载体（阴性对照）转化DH10Bac 感受态细胞，经过含有卡那霉素（50 μg/mL）、庆大霉素（7 μg/mL）、四环素（10 μg/mL）、X-gal（100 μg/mL）和 IPTG（40 μg/mL）的LB 蓝白斑筛选平板筛选后， 再经含有卡那霉素（50 μg/mL）、庆大霉素（7 μg/mL）和四环素（10 μg/mL）LB 培养基扩大培养， 用碧云天公司的杆粒提取试剂盒提取重组杆状病毒质粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid、control Bacmid（阴性对照）。

重组杆状病毒质粒通过Bac-to-Bac 系统操作手册推荐的通用引物（pUC/M13 F + pUC/M13 R）进行PCR 扩增鉴定。

3. 重组病毒以及假病毒颗粒的制备

Sf9 细胞用含10%胎牛血清的Grace’s 培养基贴壁培养， 用含无血清的Sf-900 ⅢSFM 培养基悬浮培养。 参考Invitrogen 公司的CellfectinⅡReagent转染试剂说明， 将重组杆状病毒质粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid、control Bacmid （阴性对照） 转染 Sf9 细胞，5 d 后收集细胞培养上清，即获得重组杆状病毒H5N1 HA-H7 M2 Baculoviruses（H5-M2 Bv）、control Baculoviruses（cBv）。

借助本实验室流感假病毒包装技术[3]，将pcDNA-Gag-pol、 pcDNA-GFP 和 pVRC-H5N1 HA三种质粒在lipofect 2000 脂质体介导下共转染HEK 293/17 细胞， 培养 36~48 h 后收集上清，经0.45 μmol/L 滤器过滤后即为只包含HA 膜蛋白的H5N1 HA 假病毒颗粒（H5N1 HA pp）。

4. H5-M2 Bv 滴度检测及富集

参照Invitrogen 公司的Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统操作说明，重组杆状病毒质粒在Cellfectin ⅡReagent 介导下转染对数生长期的Sf9 细胞， 培养5~7 d，待细胞出现感染病变（CPE）后收集上清液，获得初代重组杆状病毒（P0），测定滴度。 按病毒感染复数（MOI）值为0.1 感染悬浮培养的Sf9 细胞，72 h后收集上清，即为 1 代病毒（P1）；再次用 MOI＝0.1的P1 代病毒感染Sf9 细胞，72 h 后收集上清， 即为富集的2 代病毒（P2），测定病毒滴度备用。

5. 红细胞凝集活性检测

在96 孔U 型底血凝板上自左至右各孔加50 μL磷酸缓冲液 （PBS）。 自左侧第 1 孔加 50 μL 病毒液（P3 代病毒上清及浓缩纯化病毒，以H5N1 流感假病毒颗粒为阳性对照），混匀后，吸50 μL 至第2孔，依次倍比稀释至第11 孔，混匀后吸取弃掉50 μL；第12 孔只加入为红细胞对照。 最后，自右至左依次向各孔加入1%火鸡红细胞悬液50 μL， 振荡均匀后，室温下静置30 min 后观察血凝结果。

6. Western 印迹鉴定重组蛋白

VLPs 中蛋白的表达检测： 用富集的重组杆状病毒 HA-M2 Bv、cBv 分别感染 Sf9 细胞 （MOI=10），28 ℃培养 72 h，取悬液 5 000×g 离心 10 min以去除细胞碎片，收获病毒液上清；取适量病毒液上清加入 5× PEG-8000 NaCl 溶液， 每 20 分钟上下颠倒混合一次，共混合3~5 次，4 ℃放置过夜。第2 天取出，4 ℃，10 000×g 离心 50 min。 吸弃上清，加入适量的蛋白裂解液重悬病毒颗粒沉淀。 取适量裂解液行Western 印迹试验，分别用H5N1 HA、H7N9 M2 一抗检测 H5N1 HA、H7N9 M2 蛋白的表达。

昆虫细胞中的蛋白表达检测： 感染后的Sf9 细胞用细胞裂解液处理后，10 000 × g 离心 10 min，获得细胞裂解液上清， 取细胞裂解液行Western 印迹试验， 分别用H5N1 HA、H7N9 M2 一抗检测H5N1 HA、H7N9 M2 蛋白的表达。

7. 电镜观察VLPs

取适量PEG8000 浓缩纯化的VLPs， 适当稀释后取少量滴在支持膜的铜网上， 使用加速电压为80 kV 的透射电子显微镜 （TECNAI 12, FEI,Blackwood, NJ）观察 VLPs。

结 果

一、 重组杆状病毒质粒 H5N1 HA-H7 M2 Bacmid 的构建和鉴定结果

重组杆状病毒质粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid的构建示意图如图1所示。 穿梭质粒pFastDual-H5N1 HA-H7 M2 转化大肠埃希菌 DH10Bac，经LB蓝白斑筛选平板筛选，白色克隆为转座成功的阳性菌落，如图1所示。 重组杆状病毒质粒经PCR 扩增鉴定，PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析显示，大小为4 558 bp，如图1，可用于转染Sf 9 细胞。

图1 重组杆状病毒质粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid 的构建与鉴定

二、 重组杆状病毒H5-M2 Bv 滴度测定结果及Western 印迹鉴定重组蛋白

初代H5-M2 Bv 滴度约为106~107pfu/mL，病毒经过两轮富集后滴度达到108pfu/mL 以上。HA-M2 Bv感染Sf9 细胞，72 h 后取细胞及上清鉴定H5N1 病毒 HA 和 H7N9 病毒 M2 蛋白的表达。 经 H5N1 HA抗体检测， 在相对分子质量为72 000~80 000 处有特异条带，HA1 蛋白大小约 50 000，HA2 蛋白大小约30 000； 病毒液上清中也可以检测到与HA 抗体特异结合的蛋白带 (略小于细胞裂解液中的蛋白大小)，阴性对照组（cBv 感染组）在相同位置无特异带（图2）；H7N9 M2 抗体检测发现， 在 10 000~15 000 处有特异条带，收集的细胞裂解液及病毒液上清中可以检测到特异性条带，而阴性对照在相同位置无特异带（图2）。

图2 重组杆状病毒蛋白的蛋白印迹鉴定

三、VLPs 血凝活性检测

将收获的P3 代病毒液上清及富集的VLPs 上清行红细胞血凝试验， 观察到P3 代病毒液上清VLPs 有与流感H5N1 假病毒颗粒相近的血凝活性。

四、流感VLPs 的形态观察

通过透射电镜观察， 在富集的VLPs 上清液中存在形态不规则、大小与流感病毒相似的病毒样颗粒，以圆形和椭圆形为主，直径70~80 nm（图3）。

图3 病毒样颗粒透射电镜图（×59 000）

讨 论

VLPs 可作为一种新型流感疫苗， 与传统禽流感疫苗生产方法相比，它具有诸多优势[9-13]：（1）产生的病毒颗粒本身不具有传染性， 生物安全性高；（2） 采用体外细胞培养技术制备， 产能高；（3）VLPs 可以以天然构象和模式提呈抗原，能诱导较强的体液免疫和细胞免疫。 在本研究中，借助Bac-to-Bac 杆状病毒系统在Sf9 昆虫细胞中表达了2 株禽流感病毒的部分结构蛋白： 高致病性禽流感H5N1血凝素HA 蛋白和禽流感H7N9 M2 结构蛋白。通过电镜观察发现上清存在类似流感病毒的颗粒，说明来自2 株亚型流感病毒的结构蛋白可以重配组装成流感VLPs。 Western 印迹试验同样证明了2 种结构蛋白在Sf9 细胞及其上清中的表达，H5N1 HA 在昆虫细胞中同样可以成功将HA0 前体切割为为HA1 和HA2 二聚体， 并没有影响病毒颗粒的成功包装， 而且包装出的VLP 具有一定的生物活性，比如可以使红细胞发生凝集。 此外，本研究使用了本实验室流感假病毒包装平台技术制作的高致病性禽流感假病毒颗粒作为对照[14-15]，相比之下，通过昆虫细胞表达的VLP 在蛋白表达及血凝试验中表现出了与禽流感假病毒相似的生物活性。

综上，本研究中来自2 株亚型禽流感的结构蛋白可以通过杆状病毒表达系统在昆虫细胞中组成成熟的流感VLPs，且表达的结构具有与流感病毒相似的生物活性。 今后可基于此项研究探索多株禽流感病毒抗原蛋白的VLP 疫苗的制备，并进行相关动物试验验证， 以期望制备一种有效的广谱禽流感VLP 疫苗，用于禽流感的防治。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突