雷帕霉素对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞间黏附分子1 的影响

张新图，肖辉

(1.湖南中医药高等专科学校附属第一医院/湖南省直中医医院药学部，湖南 株洲 412000；2.湖南中医药大学附属第一医院药学部，湖南 长沙 410007)

0 引言

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是伴随于缺血性心脏病的病理生理过程，其受损程度可影响病情的预后，当前临床上尚缺乏针对心肌缺血再灌注损伤的有效治疗手段。雷帕霉素(rapamycin)为新型大环内酯类抗生素，常用于治疗自身免疫性疾病及器官移植排斥反应[1,2]；近年有报道称，雷帕霉素对心肌缺血再灌注损伤动物具有保护作用[3]。本研究通过制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，进一步探索雷帕霉素的心肌保护作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SD 大鼠，清洁级，♀♂各半，体重(180±20)g，由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，所有动物相关操作均经本单位动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂

雷帕霉素，美国Sigma 公司，临用前用0.5% 羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium salt, CMC-Na) 配制。氯化硝基四氮唑蓝(nitro blue tetrazolium chloride, NBT)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 试剂盒，南京建成生物工程研究所。细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)多克隆抗体及免疫组织化学试剂盒，上海哈灵生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

生物显微镜，日本Olympus 公司；自动匀浆机，金瑞鸿捷公司；冷冻离心机，德国Hettich 公司；医学影像分析系统，北京众实迪创公司；紫外可见分光光度计，美国Thermo 公司；十二导联心电图机，日本Nihon 公司；小动物人工呼吸机，安徽正华公司。

2 实验方法

2.1 心肌缺血再灌注损伤模型的制备

参照文献[4]，行冠脉结扎术。简言之，大鼠以戊巴比妥钠麻醉，仰位固定于手术台，颈部备皮、分离气管，连接小动物人工呼吸机以辅助呼吸，四肢连接十二导联心电图机以监测心电图；将左胸第3、4 肋骨处备皮、分离筋肉，将肋骨间隙撑大以暴露心脏，取缝合线穿过左冠脉前降支的起始部，于缝合线和冠脉间垫一软管，将缝合线结扎以使心肌进入缺血状态，最后将心脏纳回原处；约30min 左右可见心电图ST 段或T 波明显抬高，继而松开冠脉结扎处再灌注2h，可见抬高的ST 段或T 波明显下降。假手术组大鼠开胸但不结扎冠脉，余操作同上。

2.2 分组治疗

将30 只大鼠随机分3 组(n=10)：模型组(等体积溶媒)、雷帕霉素组(5mg/kg)、假手术组(等体积溶媒)。造模前1 周开始灌胃给药(体积按10 mL/kg)，每天1 次。

2.3 心肌梗死率的测算

再灌注结束后，动物处死，取心脏，清洗后，从心尖起将左心室平行切片，置于0.1% NBT 染色液15min，拍摄图像并通过ImagePro 软件分别测量心肌梗死区面积和心室总面积，计算心肌梗死率(%)。

2.4 检测心肌MPO 活力

取部分洗净的心脏，匀浆，低温离心10min(3500r/min)后取上清，上紫外可见分光光度计比色法测定光密度(OD)值，并按说明书规程计算MPO 活力(U/g)。

2.5 检测心肌组织ICAM-1 表达

取部分洗净的心脏，固定于4%多聚甲醛液，按免疫组化说明书规程，常规脱水、包埋、切片、封片，采集图像，导入医学影像系统进行分析，ICAM-1 阳性表达以积分光密度(IOD)值表示。

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 雷帕霉素对心肌梗死率的影响

假手术组大鼠心肌未见梗死，模型组心肌梗死率37.92%，雷帕霉素组可使心肌梗死率降低至31.99%，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 各组大鼠心肌梗死率比较(± s, n = 10)

3.2 雷帕霉素对中性粒细胞浸润的影响

模型组动物心肌MPO 活力显著升高至425.70 U/g，与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；雷帕霉素组心肌MPO活力明显降低至332.69 U/g，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，提示雷帕霉素可减轻中性粒细胞浸润程度，见图2。

图2 各组大鼠心肌MPO 活力比较(± s, n = 10)

3.3 雷帕霉素对心肌ICAM-1 表达的影响

假手术组心肌组织ICAM-1 表达极低，模型组动物心肌 组 织ICAM-1 表 达 则 明 显 升 高(IOD 值：24.93 ± 4.98)，组间差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，雷帕霉素组可显著降低心肌组织ICAM-1 表达(IOD 值：17.06 ±4.17)(P＜0.01)，见图3。

图3 各组大鼠心肌ICAM-1 表达比较(±s, n = 10)

4 讨论

心肌缺血再灌注损伤仍缺乏行之有效的防治方法，目前其治疗措施主要有：①模拟内源性保护剂；②清除氧自由基；③抗细胞凋亡；④减轻细胞内Ca2+超载；⑤抑制炎症反应；⑥缺血预处理(ischemic preconditioning，IP)等。缺血预处理使人们对器官保护产生了新的认识，但往往因伦理问题而难以在临床上推广开来。近年来有学者提出药物预处理(pharmacological preconditioning，PP)的新策略，通过药物预处理，提前激活内源性保护途径，抑制机体内源性毒性物质的产生，阻断继发性损伤的级联反应，或促进机体释放生物活性物质，以增强心肌对缺血再灌注损伤的耐受[5,6]，这对探索心肌缺血再灌注损伤的临床治疗方法具有重要意义。本研究采用心肌缺血再灌注损伤发生前1 周口服雷帕霉素的预处理方式，结果表明雷帕霉素能显著降低心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌梗死率，提示雷帕霉素具有心肌保护作用。

炎症反应是缺血再灌注引发间接损伤的重要病理特点之一，主要表现为炎症细胞( 如中性粒细胞) 聚集浸润、多种炎性细胞因子和黏附分子过度表达等[7]；抑制炎症反应可能成为防治心肌缺血再灌注损伤的有效手段[8]。心肌缺血再灌注损伤发生时炎症细胞因子被激活，诱导大量的炎性细胞黏附于血管内皮细胞，进而促使蛋白水解酶、氧自由基、收缩血管因子等参与心肌缺血再灌注损伤进程，缺血区的炎症细胞则同时分泌大量的细胞因子及炎症介质，如白介素(interleukin)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)、核转录因子-κB(nuclear factor kappa B)、MPO 等，这些因子诱导缺血区内皮细胞表达更多的细胞间黏附分子1(ICAM-1)、P 选择素及E 选择素等，进而介导中性粒细胞黏附于内皮细胞并浸润到心肌组织，既可影响凝血系统减少血供，又可释放蛋白水解酶破坏血管壁的完整性，造成心肌细胞受损或其功能降低[9-11]。研究证实，大鼠缺血心肌组织中性粒细胞数量明显比正常心肌组织高，并可在再灌注2 h 时达到最高点[12]；而抑制中性粒细胞活化及浸润则可减轻心肌受损程度[13]。本研究结果表明，再灌注2 h 后中性粒细胞标志物MPO 酶活力明显增高，提示中性粒细胞的浸润严重，雷帕霉素预处理可使心肌MPO 酶活力显著降低(P＜0.01)，表明雷帕霉素可通过减少中性粒细胞活化，抑制其浸润，实现心肌保护作用。

黏附分子ICAM-1 为免疫球蛋白超家族成员之一，又称CD54，体内存在于多种细胞表面，介导细胞间的黏附作用；ICAM-1 在正常心肌细胞表面仅有微量表达，当心肌缺血再灌注发生时在细胞因子(NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α 等)的诱导下会过量表达，与淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1) 及巨噬细胞活化趋化因子-1(Macrophage activation chemokine 1)结合，参与炎症级联反应[14]。在ICAM-1 介导下，可促使血液中白细胞激活和血管内皮细胞活化，大量白细胞迁移、积聚到心肌缺血区，进而与血管内皮细胞黏附，这些白细胞可活化血小板及凝血系统，引起血栓形成和微循环不畅，减少缺血区的血供；同时本身又会释放多种蛋白水解酶、过氧化物、炎症介质等，蛋白水解酶可解离血管内皮细胞和基底膜细胞，破坏血管壁的完整性，使炎症细胞容易通过并聚集到缺血区，过氧化物和炎症介质可进一步损伤心肌细胞，造成心肌缺血再灌注损伤的加重[15]。据报道，实验动物心肌组织中性粒细胞浸润数量与ICAM-1的表达呈现显著的正相关[16]。本研究结果表明，再灌注2 h后心肌ICAM-1 表达明显增高，提示ICAM-1 的高表达参与了缺血再灌注损伤的病理进程，这与上述报道结果类似；雷帕霉素组心肌ICAM-1 表达明显降低(P＜0.01)，提示雷帕霉素可通过抑制ICAM-1 表达，减少中性粒细胞等炎性细胞在缺血区的黏附及浸润，缓解了心肌缺血区的炎症反应。

总之，雷帕霉素预处理可保护心肌缺血再灌注损伤大鼠的受损心肌组织，其作用机制可能与减少中性粒细胞浸润、抑制黏附分子ICAM-1 高表达、缓解炎症反应等有关。