口蹄疫灭活疫苗保存及稳定性研究

刘国民，高日明，尚 策，宋庆庆，王 凯，陈炳全，朱修泽

（金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

口蹄疫灭活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、稳定性决定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是无囊膜病毒，对氯仿不敏感，对温度、酸碱度比较敏感，当pH变化或温度升高时完整病毒146S容易分解。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅度降低，生产中如何保护146S抗原完整性又要保证疫苗纯度，两者关系是工艺攻关难点，完整病毒粒子配合优质佐剂，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，进而保护易感动物不被口蹄疫病毒感染，最终使口蹄疫灭活疫苗起到防控疫病的作用。

疫苗生产是系统工程，包括细胞培养、病毒放大生产、纯化浓缩、分装乳化、保存、使用等工序。临床使用时，合格的疫苗必须具备安全、高效、均一、稳定的特性；生产过程中采用合理的保存温度和浓度，有助于延长病毒的保存期和维持较高的抗原水平，对生产中抗原的保存具有重要意义。本文通过对不同毒株热稳定实验、半成品不同温度、浓度下146S变化、同时通过成品疫苗保存期实验及挑战实验等证明不同的口蹄疫毒株对温度敏感性不同，半成品、成品疫苗对温度、酸碱度比较敏感，2~8℃是成品疫苗最佳保存条件，希望本文研究结果对疫苗稳定性方面研究，有一定指导作用。

1 材料

1.1 口蹄疫毒株病毒液

分别收集培养好的A/WH/09毒株液、O/MYA98毒株液、OR/80毒株液及OZK/93毒株液，各取1 000 mL备用。

1.2 口蹄疫半成品原液及浓缩液

A/WH/09、O/MYA98口蹄疫灭活半成品原液各1 000 mL，由金宇保灵公司生产部提供。

1.3 口蹄疫成品灭活疫苗

OA型口蹄疫灭活成品疫苗，数量20瓶由金宇保灵公司生产部提供。

1.4仪器与试剂

CO2培养箱、96孔板、培养瓶、DMEM营养液、微量滤器、冻存管、铝制方箱，高压锅或水浴锅等、206佐剂、超速冷冻离心机，紫外分光光度计，生物安全柜，玻璃容器，移液器等；2～8℃冰箱；-20℃冷冻冰箱；BHK21细胞。

2 方法

2.1 不同口蹄疫毒株热稳定性实验

将A/WH/09毒株、O/MYA98毒株、OR/80毒株及OZK/93毒株病毒样品，先进行批量解冻，将毒液分装成10 mL离心管12只，将不同口蹄疫毒株在90℃热水浴锅中灭活1～8 min，检测TCID50，并记录数据，主要考察口蹄疫毒株对温度的敏感性。

2.2 口蹄疫半成品在不同温度和浓度条件下146S影响实验

随机抽取本公司生产部灭活抗原液及其相应批号的10倍浓缩纯化液，分别取样进行初始样品146S含量的测定；将原液样和10倍浓缩后样液分装，20 mL/瓶，每种样品分2组，分别在-20℃和4℃冰箱中保存7个月，每月定期各取出1个样品分别进行146S的测定。

2.3 口蹄疫成品灭活疫苗保存期试验及反复冻融挑战实验

将同批次的20瓶OA型口蹄疫灭活成品疫苗分成2组，一组2～8℃保存12个月，每月抽检一瓶；另一组做-20℃挑战实验，保存8瓶并反复冻融5次，冻融后检测抗原含量。

3 结果

3.1 不同口蹄疫毒株热稳定性实验

从表1、图1数据分析可知：A/WH/09毒株的温度稳定值最低，说明A/WH/09毒株对温度比较敏感，弱于其他毒株，而O/MYA98、OZK/93在90℃条件下裂解8 min后，检测不到有效病毒，说明O/MYA98、OZK/93毒株比较稳定。

图1 不同口蹄疫毒株对90℃热水浴稳定性实验

表1 90℃热水浴对不同口蹄疫毒株的稳定性实验（TCID50）

3.2 口蹄疫半成品原液、浓缩液在4℃和-20℃条件下保存期实验

从表2、图2、图3数据分析可知，口蹄疫半成品在4℃和-20℃保存的7个月中，完整病毒146S粒子的含量均有所下降。4℃保存条件下，原液样和浓缩样完整病毒146S粒子的降解分别为27.5%、12.3 %；-20℃保存条件下，其降解率分别为87.5%、92.4%。从本实验数据证明，4℃比-20℃保存条件更有利于抗原的保存，浓度对抗原保存影响不显著。

图2 原液样品1-7月146S变化曲线

图3 浓缩后样品1-7月146S变化曲线

表2 口蹄疫半成品在不同温度和浓度条件下对完整病毒146 S检测结果 μg/mL

3.3口蹄疫成品疫苗2～8℃保存期实验

从表3、图4数据可知，口蹄疫 A 型、 O型灭活疫苗在2～8℃分别放置 12 个月，每月采用蔗糖密度梯度离心定量法检测146S含量，结果发现146S抗原含量基本没有变化,说明疫苗有效抗原保存比较好，完整病毒粒子保存完整。

图4 口蹄疫灭活疫苗在2～8℃保存期实验

表3 口蹄疫O型、A 型灭活疫苗保存期实验

3.4 口蹄疫灭活疫苗反复冻融挑战实验

从表4、图5数据可知，将口蹄疫灭活疫苗多次冷冻融化后，抗原含量降解比较多，每次反复冻融抗原损失10%～20%左右，5次反复冻融后，抗原损失50%左右，因此在保管疫苗时尽量不要冻融。冻融后的疫苗坚决不能使用，因为完整病毒粒子146S已经裂解为无效的12S五聚体。

图5 口蹄疫O型、A型灭活疫苗反复冻融后146s抗原含量变化(μg/mL)

表4 口蹄疫O型、A型灭活疫苗反复冻融后146S变化

4 讨论

4.1 不同口蹄疫毒株热稳定性实验

口蹄疫灭活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S粒子）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、稳定性决定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是无囊膜病毒，对氯仿不敏感，对温度、酸碱度等物理、化学物质比较敏感，如果保存不当、pH变化或温度升高时，完整病毒146S容易分解为五聚体即12S。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅度降低，因此工艺控制及保护完整病毒粒子不降解是各个生产企业的绝密技术，如口蹄疫病毒的纯化、浓缩、保存技术都是口蹄疫生产中很难突破的技术，生产中如何保护146S 抗原完整性又要保证疫苗纯度，两者关系是工艺攻关难点，完整病毒粒子配合优质佐剂，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，进而保护易感动物不被口蹄疫病毒感染，最终使口蹄疫灭活疫苗起到防控作用。

4.2 口蹄疫半成品原液、浓缩液在4℃和-20℃条件下保存期实验

146S是指口蹄疫病毒在繁殖子代病毒过程中，由病毒衣壳和基因组共同组成的完整粒子，不是所有的抗原都能产生有效抗体，能刺激机体产生有效抗体的抗原才称为有效抗原，口蹄疫完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的沉降系数为146S，所以我们就用146S来代表口蹄疫疫苗的有效抗原。目前146S评价方法有蔗糖密度梯度离心法、 紫外分光光度计定量法、液相色谱仪定量法、ELISA 检测法等4种检测方法，但蔗糖密度梯度离心法是OIE推荐的金标准检测方法，大部分疫苗生产企业用此方法进行定量添加抗原，因为完整的 146S 抗原上有口蹄疫病毒的所有中和位点，能有效刺激动物机体产生抗体，因此完整的146S粒子的浓度多少，可作为一项评价口蹄疫疫苗质量的标准。

4.3 口蹄疫疫苗抗原稳定性与免疫原性的关系

稳定的抗原、有效的佐剂是疫苗研究的重点和难点。灭活疫苗在长期储存、加热和微酸性环境中，病毒颗粒极其容易裂解，裂解产物也被称为12S，12S是一个由VP1，VP2，VP3组成的五聚体。因为五聚体之间存在大量的组氨酸残基，在酸性环境下组氨酸会迅速发生质子化，释放正电荷，通过静电排斥作用引发粒子裂解，这正是口蹄疫疫苗不稳定的原因。由于146S粒子在酸性环境下分解成12S 粒子，而12S表面的免疫反应位点被隐藏或发生形变的缘故，使12S不具备任何免疫原性，无法激发机体产生抗体，降低了口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒会在高温状态下，使组合状态的 12S 粒子转化为分解状态，因此口蹄疫疫苗不宜长期暴露在高温状态下，口蹄疫疫苗效力与口蹄疫灭活疫苗中的 146S 粒子数量有关，若是能够确保 146S 粒子稳定不被分解，那么口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保护，这也是口蹄疫灭活疫苗需2～8℃保存的机理。口蹄疫抗原稳定性差给口蹄疫疫苗的生产、储存和应用带来了很多困难，使用过程中必须全程冷链运输以保护口蹄疫疫苗的免疫原性。

4.4 口蹄疫疫苗抗原保护剂、储存、运输

口蹄疫病毒抗原对酸和热极其敏感，为了保证疫苗质量，生产商采取研发疫苗抗原保护剂，增加昂贵的冷链运输系统，将优质疫苗送到用户手中。如何保障疫苗抗原不降解或降解速率慢，是疫苗生产企业的难点，但金宇生物一直采用自主研发的UTM保护剂，从工艺技术上保障疫苗稳定性，从运输环节上采用无死角的2～8℃冷链运输，使客户用上最好、最新鲜的疫苗。不论后续口蹄疫疫苗技术如何革新，对口蹄疫病毒粒子的完整性和稳定性研究，一直是广大科技从业者长期努力和研究的方向。