某鸡场死亡鸡胚中细菌的分离鉴定和药敏试验

王秋生

（江苏省海安市畜牧兽医站 226600）

在导致鸡胚死亡的众多原因中，细菌是常见原因之一，国内外有不少因细菌感染而造成鸡胚大量死亡的实例。研究表明，部分禽病如传染性支气管炎、鸡伤寒、葡萄球菌病，这类禽病的病原菌或病毒传递给后代的主要途径是侵害种禽卵巢，造成严重的危害。部分禽病如大肠杆菌病传递给后代的途径有两种，一是通过蛋壳，二是通过蛋内。通过携带病原菌的粪便污染蛋壳，从而在孵化过程中造成不同程度的影响，另外可以引发一系列的禽类生殖器官方面的疾病，继而可通过蛋传递，造成大批禽胚的死亡[1]。

为了搞清在孵化过程中导致鸡胚死亡的细菌种类及其检出率，需要对死亡鸡胚进行细菌的分离与鉴定。2021 年3 月海安市某养鸡场送检的80 份死亡鸡胚，经实验室诊断为细菌感染。本文对该病原菌进行了分离与鉴定，以及药敏试验等，从细菌方面去分析鸡胚死亡的原因，为提高种蛋孵化率提供理论依据，以此提高经济效益[2]。

1 材料

1.1 病料

2021 年3 月海安市某养鸡场送检的80 份死亡鸡胚。

1.2 药品试剂和器材

1.2.1 药品试剂

药品试剂：乙醇、碘酊、福尔马林溶液、生理盐水、乙醚、6%α 萘酚乙醇溶液、40%氢氧化钾溶液、革兰氏染色试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、药敏纸片。

培养基：普通营养琼脂平板、血液琼脂平板、麦康凯琼脂平板、EMB 平板、糖发酵试验培养基、三糖铁培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。

1.2.2 器材

镊子、剪刀、接种环、移液枪、托盘、广口试剂瓶、眼科剪子、载玻片、盖玻片、抗凝离心管，光学显微镜、超净工作台、冰箱、恒温培养箱、PCR 仪、凝胶电泳仪、生物安全柜等。

1.3 引物

细菌的PCR 扩增中通用引物为27F 和1492R，如下。

引物27F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。

引物1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

扩增长度约为1400bp。

2 方法

2.1 病理剖检

在送来的80 份死亡鸡胚中随机取样，抽取20 只死亡鸡胚进行剖检，观察尿囊液的变化和内脏的病理变化，记录结果。

2.2 细菌的分离培养

在超净工作台上，先用75%酒精对死亡鸡胚进行消毒，然后用镊子敲碎蛋壳一侧，再用灭菌的眼科镊子把壳膜撕开，扒出气室。用镊子将鸡头压住，再操作移液枪吸取尿囊液，存放至抗凝离心管中。对从死亡鸡胚中分离出的尿囊液材料采用平板划线法进行分离培养，使用无菌接种环沾取少许液体在平板上连续划线，经过37℃下培养约24h 可得到单菌落，然后再分辨不同形态特征的单菌落，挑取后进行纯培养。

从纯培养的单菌落中挑取培养物进行革兰氏染色试验，观察其形态及在培养基上的培养特性。

2.3 生化试验

穿刺接种糖发酵试验管、三糖铁培养基。进行甲基红试验、吲哚试验、VP 试验。进行培养并记录结果，判定标准可参照该公司操作方法与标准[3]。

2.4 溶血性试验

从培养基中挑取不同分离菌的单个菌落接种至血平板上，培养温度为37℃，培养时间为24h，再观察培养基中是否出现溶血现象。

2.5 16S rDNA 扩增和测序

将试验中分离到的细菌依照细菌基因组DNA 提取试剂盒的说明书制备DNA 模板，采用通用引物扩增出细菌16S rRNA序列，再将目的片段进行切胶纯化后送生物公司进行测序，测序后将其结果与BLAST 和GenBank 公布的序列进行比对分析，鉴定细菌种属。

若测得的序列与基因库中细菌的比对同源性达到97%以上则可认为是同一种细菌。

2.6 药敏试验

采用纸片扩散法。

3 结果

3.1 剖检变化

部分死亡鸡胚剖检结果为卵黄囊发炎，卵黄有吸收不良现象，大部分有黄绿色干酪样物质。部分死亡鸡胚剖检可观察到机体消瘦和关节局部化脓的现象[4]。

3.2 细菌的分离培养

从送检鸡胚尿囊液中分离细菌，于血平板上培养24h 后，结果共分离到7 种细菌，本试验中分别命名为B1～B9，将分离到的细菌进行纯培养。

3.3 细菌形态学观察

37℃培养24h 后显示，B1在平板上形成比较大的白色或略带一些灰色的表面光滑、湿润的大菌落，大部分呈不透明状，少部分边缘少许透明，B2、B4在平板上形成圆形凸起状、表面光滑湿润的菌落，边缘整齐，不透明，B3、B9在平板上形成圆形凸起状、露珠状的菌落，B5、B6在平板上形成圆形、表面光滑的黄色菌落，不透明，B7在平板上形成圆形凸起状、表面光滑湿润的白色露滴状菌落，呈半透明状态，B8在平板上形成圆形、表面光滑的灰色菌落，直径约为1mm 左右。

挑取B1～B9单个菌落进行革兰氏染色镜检，结果显示：B1、B3和B9为革兰氏染色阴性杆菌，B1菌体呈两端钝圆状，多数为单个散在或者成对存在，偶尔有2～3 个菌体相连，菌体直径约为0.4～2.0μm。B3、B9为革兰氏阴性小杆菌，菌体呈单个散在、成对存在或丝状存在，菌体直径约为0.2～0.4μm×1～5μm，无芽孢，不运动；B2、B4、B5、B6、B7和B8为革兰氏染色阳性菌，B2、B4、B5和B6菌体呈球形或椭圆形，排列成葡萄状，菌体直径约1.0μm，无芽孢，无鞭毛，B7为革兰阳性短杆状或球杆状，排列不规则，B8 为革兰氏阳性球菌，呈四联、成团块状排列，也有单个成双排列。

3.4 溶血试验结果

B1出现明显溶血现象，B2、B4出现明显的β 溶血现象，B3、B9无溶血现象，B5、B6在血培养基上出现透明的溶血环，B7不溶血，B8 出现α 溶血现象。

3.5 生化鉴定结果

结果见表1。

表1 生化试验结果

3.6 16S rDNA 的序列分析

对16S rDNA 引物进行PCR 反应，电泳结果显示扩增出与预期大小相符合的条带。目的片段送至公司测序，结果鉴定出B1为大肠埃希菌，B2为腐生葡萄球菌，B3为鸭疫里默氏杆菌，B4为葡萄球菌，B5为松鼠葡萄球菌，B6为松鼠葡萄球菌，B7为棒状杆菌，B8为气球菌，B9为鸭疫里默氏杆菌。

3.7 药敏试验结果

结果见表2 及表3。

表3 G+分离菌药敏试验结果

4 小结与讨论

本试验通过分离培养和染色镜检观察细菌形态，并将分离到的细菌进行生化试验。通过16srRNA 方法对分离所得的细菌进行鉴定，经鉴定分别为大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、棒状杆菌、气球菌。可以确定该批鸡胚的死亡与感染细菌有很大关系。

4.1 对生化试验和溶血试验等结果的讨论

此次分离得的7 种细菌生化试验结果如上文结果所示，基本与各菌的生化特性相符合。另外，大部分分离菌在血平板上出现了明显的溶血现象，这说明分离所得的大肠埃希菌、葡萄球菌、气球菌具有一定的致病性。

4.2 对药敏试验结果的讨论

由药敏试验结果表可知，从死亡鸡胚中分离到的7 种细菌在不同抗生素药物作用下的药敏试验数据能有效筛选出适合防治细菌感染病的药物[5]。

4.3 对防治鸡胚感染细菌的建议

在研究和生产实践中表明，本试验在死亡鸡胚中分离所得的大肠杆菌、葡萄球菌、鸭疫里默氏菌等均是影响鸡胚发育的常见病原菌，棒状杆菌和气球菌则比较少见，提醒人们在防治鸡病过程中应注意到可能会存在一些不常见细菌的混合感染。此次分离的不少菌株是条件性致病菌，与鸡群的免疫力也有着密切的联系。对细菌造成的鸡胚疾病的防治重点在于，因为细菌感染鸡胚从而影响鸡胚发育生长的途径主要有两种，一是母体垂直传播感染，二是受外界环境污染所致，所以要预防细菌感染鸡胚也要从两个方面采取措施，一是预防种鸡感染细菌，二是减少鸡胚受环境污染[6]。

根据药敏试验结果可有效筛选适合用于防治这些细菌感染病的抗生素。不过在使用抗生素药物时也要考虑细菌耐药性，尤其是极易产生耐药性的大肠杆菌，应更加严谨合理地选择用药，避免滥用抗生素，减少细菌耐药性的产生，同时还要注意按时按量用药及交替用药，最大程度的降低养殖户的损失。在本次试验中，重点观察本次分离所得的松鼠葡萄球菌对本次药敏试验所用的药物均不敏感，需进行更多的试验寻找能对其产生抑制作用的药物[7]。

除了采取药物措施外，还应加强饲养管理方面问题，提供良好的禽舍环境，避免不良应激因素对鸡群造成的影响，同时需经常对环境进行消毒防疫，保证鸡群生长环境的卫生。这样才能增强鸡群自身的免疫力，减少条件性致病菌引发疾病的概率[8]。

总之，本试验从80 份死亡鸡胚中成功分离鉴定出7 种细菌，为查明该鸡场鸡胚死亡的主要因素是细菌性感染提供了试验依据，药敏试验研究结果为该鸡场对细菌性疾病的防治用药提供了数据支持。此外，这7 种细菌中的一些分离菌对鸡的致病能力还存在未知部分，需要通过更多的试验去深入研究。