芹菜素经上调miR148a-3p 表达抑制MHCC97H 细胞迁移和侵袭

刘丽华，孙 菲，周志凌，张坚松

（1. 珠海市人民医院/暨南大学附属珠海医院，珠海 519000；2. 湖南师范大学医学院，长沙 410013）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高侵袭转移是亟待解决的临床治疗难题［1］。新近的研究显示非编码调控性微小RNAs（microRNAs）能有效地抑制HCC 细胞迁移和侵袭［2，3］。我们先前的研究证明芹菜素（apigenin，API）类似物异牡荆素抑制HCC 肿瘤干细胞特性和侵袭能力［4］，然而，其作用机制尚未完全阐明。本文旨在研究API 是否通过上调miR-148a-3p 表达抑制体外HCC 细胞迁移和侵袭能力。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理 高侵袭性人肝细胞癌MHCC97H 细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海市）。按照先前文献的描述［4］，细胞放置在37°C、饱和湿度的5% CO2 培养箱中单层贴壁生长；然后，通过阳离子脂质体转染miR-148a-3p 模拟物或不同浓度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）联合miR-148a-3p 抑制物转染MHCC97H 细胞处理24 小时。

1.2 miRNA 转染 如先前文献［5］的阐释的方法，按照制造商的说明（RiboBio，中国广州市），用iboFECT™CP 试剂将micrON™miR-148a 模拟物（50 nM）或抑制物（100 nM）转染入MHCC97H 细胞。同时，按照相同的方法和步骤转染miR-148a-3p 模拟物的阴性对照（miRCtrl）或miR-148a-3p 抑制物的阴性对照（Anti-Ctrl）。

1.3 实时定量PCR 参考文献［5］的实验方法，用miRcute miRNA 分离试剂盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中国）制备总microRNA。基于TaqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One™miRNA qRT-PCR 检测试剂盒转录和扩增总miRNA（2μg），以测定microRNA 的量。用2-ΔΔCt方法分析结果。研究使用的引物是：成熟miRNA-148a-3p（F：TGCGGTCAGTGCACTACAGAAC；R：CCAGTGCAGGGTVVGAGGT）和内参U6（F：5'-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3'；R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3'。

1.4 划痕法 参照文献［4］的描述，转染的MHCC97H细胞或不同浓度的API（apigenin，API：5、10 和20μM）或API（20μM）联合miR-148a-3p 抑制物处理细胞接种于6 孔细胞培养板，生长至90%汇合度。然后，用无菌的100μL 微量移液器的吸头垂直划过形成伤口。接下来，洗涤细胞并分别于0 和24h 时在放大倍数为100 的视野中拍照分析。miR-Ctrl 或Anti-Ctrl 或溶媒（0.1%DMSO）处理MHCC97H 细胞用于标化迁移细胞率（%）。

1.5 Transwell 小室侵袭试验 参照文献［4］的描述，用基质胶包被的8μm 孔膜Transwell 系统（Corning Incorporated，NY，USA）进行细胞侵袭测定。简而言之，在有或没有API 的况下，无血清DMEM 培养基悬浮的MHCC97H 细胞接种入上室。含10%胎牛血清完全培养基加入下室中，作为化学诱导剂，培养24 小时。侵袭细胞用甲醇固定，并行瑞氏染料染色，并用Vectashield 固定溶液（Vectorshield，Vector Laboratories）固定。光学显微镜（Olympus DP72，德国汉堡）拍照（放大倍数：200）。

1.6 统计学处理 用SPSS 20.0 软件（IBM，Armonk，NY，美国）进行统计分析。数据为平均值±标准差。非配对双尾Student’s t 检验比较实验组与对照组之间的均数。用单因素方差分析的post-hoc Tukey's 检验进行各组均数的两两比较。P<0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-148a-3p 抑制MHCC97H 细胞迁移能力

图1 显示：miR-148a-3p 转染显著降低体外培养MHCC97H 细胞迁移率（P<0.05）。

图1 miR-148a-3p模拟物抑制体外培养MHCC97H细胞迁移能力（mean±SD，n=3）

2.2 miR-148a-3p 降低MHCC97H 细胞侵袭率 图2可见：miR-148a-3p 显著降低体外培养MHCC97H 细胞侵袭率（P<0.05）。

图2 miR-148a-3p模拟物抑制体外培养MHCC97H细胞侵袭能力（mean±SD，n=3）

2.3 API 上调MHCC97H 细胞miR-148a-3p 表达图3 示：与0.1 % DMSO 处理的MHCC97H 细胞相比，API（5、10 和20μM）以浓度依赖方式增高MHCC97H 细胞miR148a-3p 表达水平（P<0.05）。

图3 API显著上调MHCC97H细胞miR-148a-3p表达（mean±SD，n=3）RT-qPCR分析MHCC97H细胞miR-148a-3p表达水平。与溶媒（0.1%DMSO）处理的MHCC97H细胞相比：* P<0.05 ；与5.0μM API处理的MHCC97H细胞相比：#P<0.05。

2.4 API 抑制MHCC97H 细胞迁移和侵袭能力 如图4 所示：API（5、10 和20μM）以浓度依赖方式降低MHCC97H 细胞迁移和侵袭率（P<0.05）。

图4 API剂量依赖性抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭（mean±SD，n=3）

2.5 miR-148a-3p 抑制物拮抗API 抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭作用 miR-148a-3p 抑制物增强MHCC97H 细胞迁移（图5 A；P<0.05）和侵袭能力（图5 B；P<0.05），并且miR-148a-3p 抑制物能消除API 抑制细胞迁移和侵袭作用（图5 A 和4B；P<0.05）。

图5 miR-148a-3p抑制物对API抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭的影响（mean±SD，n=3）

划痕法和Transwell 小室法分别测定MHCC97H 细胞迁移（A）和侵袭（B）率。与miR-148-3p 抑制物阴性对照（Anti-Ctrl）转染的MHCC97H 细胞相比：*P<0.05；与单独API（20μM）处理的MHCC97H 细胞相比：#P<0.05；与单独miR-148a-3p 抑制物转染的MHCC97H细胞相比：$P<0.05。

3 讨论

HCC 的高侵袭转移特性是其致死的主要原因之一［1］。有研究表明，miR-148a 作为癌基因能增加IDH1 R132H 突变的人胶质瘤细胞迁移和侵袭；与此相反，miR-148a 作为抑癌基因有效抑制人胃癌［7］、卵巢癌［8］和非小细胞肺癌［9］，包括HCC［10］细胞增殖、迁移和侵袭能力。与Huang 等报告的结果一致，本文的结果再次证实miR-148a-3p 模拟物有效地降低HCC 细胞迁移率和侵袭率。

API 属于无基因毒性的饮食黄酮类化合物。Wang等人［11］最近报道API 通过影响microRNA 转录本的表达抑制HCC 细胞生长。我们先前的研究证实API 的糖苷类化合物（异牡荆素）具有抑制HCC 肿瘤干样细胞迁移和侵袭作用［4］，然而，其作用分子机制有待深入研究。在本文的研究中，我们提呈了一种新的API 药理分子机制认识，即：API 通过上调miR-148a-3p 表达有效地抑制HCC 细胞迁移和侵袭能力。在随后的研究中，我们拟探讨API 以何种方式上调miR-148a-3p 表达以及miR-148a-3p 转录后调控何种或哪类靶基因发挥抑制人HCC 迁移和侵袭作用。