山西省仔猪黄白痢大肠杆菌耐药性研究

冯晓东，刘风波，连亮亮

(1.吕梁农业学校，山西 吕梁 032200；2.长治市襄垣职业技术学校，山西 长治 046200；3.长治市农业综合行政执法队，山西 长治 046000)

仔猪黄白痢为新生仔猪常见的大肠杆菌病，会严重危害养猪生产，并会造成巨大的经济损失。对于本病的防治，猪场除了加强饲养管理和卫生消毒措施，以及用自家流行菌株免疫母猪，唯有多选用敏感药物进行治疗；然而，大肠杆菌具有众多的血清型，各地流行菌株的血清型各不相同。随着抗生素的大量使用，大肠杆菌的耐药性菌株也不断出现。为了摸清山西省各地仔猪黄白痢流行病原菌株，指导猪场临床用药，本研究对省内各地猪场的新生仔猪黄白痢病例进行了病原分离、鉴定和耐药性监测。

原文：England are home to 200 different nationalities.

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料

随着国家供给侧改革以及更为严格的安全环保政策的不断推进和深化，中国农药行业正在变革，不少企业不得不停产整顿，甚至面临被淘汰的风险。

因发生仔猪黄白痢，山西省10家规模化猪场仔猪病死60例，在仔猪死后24 h内，采集病变的组织或器官样本，采集过程中要尽可能避免样本被污染。

1.1.2 质控菌株

称取营养琼脂4.5 g溶于100 mL蒸馏水中，加热溶解，然后放入高压锅高压灭菌20 min。待冷却至50 ℃～60 ℃之后取出，在超净工作台内将溶液倾倒入经过灭菌的平皿中，待其冷却凝固后取病料接种菌种。接种完毕后置于37 ℃恒温箱中培养24 h备用。

按常规方法进行三糖铁试验、吲哚试验、甲基红验、二乙酰试验、糖发酵试验、柠檬酸盐利用试验。

2.1 两组DDI及DDI各阶段时间的比较 观察组产妇的DDI以及决定手术至麻醉开始时间低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而两组的麻醉时间、手术切皮至胎儿娩出时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

试验所用仪器设备有比浊管、试管、培养皿、接种环、酒精灯、恒温培养箱、冰箱、打孔器、真空抽气机、干燥器、测量尺、电子天平、超净工作台。

1.1.4 标准比浊管的制备

取10支比浊管，给第1支比浊管装入0.048 mol/L(即浓度为1.175%)氯化钡0.5 mL，加0.18 mol/L(即浓度为1%)硫酸溶液99.5 mL，充分搅匀，随后的9支浊管依次类推，浓度逐渐升高。选管径与接种菌液相同的试管，每支分装10 mL，密闭，在室温下置于暗处保存,其浊度为0.5麦氏比混标准(Mcfarland standard)，相当于108CFU/mL的含菌量。使用前应充分摇匀[1]。

1.1.5 接种菌液的制备

大肠埃希菌ATCC25922购于中国兽药监察所。

用灭菌的接种环挑取琼脂平板上形态相同的4～5个菌落，接种于3 mL～5 mL水解酪蛋白(mueller-hinton，M-H)肉汤中，在35 ℃下培养6 h，随后用灭菌生理盐水稀释培养液，使其浓度相当于标准比浊管[2]。

1.1.6 培养基的制备

制备普通营养肉汤、普通营养琼脂、葡萄糖蛋白胨、M-H培养基(K-B试验专用）琼脂。

为了全面地把握普查绩效的综合状况，克服评价的片面性，将普查绩效评价的五个主要因素对应各评价等级的隶属度模糊量值计算其平均值、最大值与最小值，分别记为dk1，dk2，dk3。结合其相应的权重，建立单项评价模糊复合物元Rd和综合评价模糊复合物元RD，则有：

1.1.7 试验药物

制备好的干燥药敏纸片分装在密封小瓶内，放在干燥器中低温保存备用。

氨苄青霉素(ampcillin，Amp)、氯霉素(chloramphenicol，CM)、红霉素(eryhromyci，Ery)、庆大霉素(gentamicin，GM)、丁胺卡那霉素(amikacin，Amk)、链霉素(gtreptomyces，SM)、复方新诺明(gulfamethoxazole，Sxt)、新霉素(neomin，N)、呋喃唑酮(furazolidone，Fd)、诺氟沙星(norfloxacin，Nor)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、头孢唑啉(cefazolin，Cfz)、强力霉素(doxcycline，Dox)、氟苯尼考(florfenicol，FLO)、多粘菌素(polymyxin，PXB)和恩诺沙星(enoxacin，ENO)共16种药物纯粉。

1.1.8 药敏纸片的制备

2.动物园游览时间集中在周末和自由支配时间，这既说明动物园游客来自工薪阶层，又体现出其休闲旅游的典型特征。游客信息获取渠道分散，说明动物园并没有为此过多宣传。但门票价格影响因素分析发现，游客总体上还是觉得门票价格偏高，而西乡塘区外和多次游览及非周末假期游览的游客对门票价格的敏感度显著降低。

她不仅在农科校打响，在乡政府内也起到意想不到的作用。何副书记在她面前很庄重，而且不再松松垮垮，各站也不在上班时间打扑克了。因为她非要何副书记定几条《规章制度》《惩罚条例》不可。奇怪的是，何副书记对她言听计从，马上照办。然而令人费解的是，李文和几个放荡惯了的人对她心怀不满，背后说她坏话时，何副书记却听之任之，充耳不闻，置之不理。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离培养

神像高一丈，身体由整块的白玉雕凿而成，双翼则是用青碧色的翡翠雕刻。一束月光从神殿顶部预留的天窗直射而下，打在神像上，令神像的身体泛起柔柔的白芒，双翼青光流转，仿佛随时都要振翅冲天。

挑选单个菌落，经染色镜检证明不含杂菌，此时用接种环挑选单个菌落，移植于各种琼脂斜面培养，所得的培养物即为纯培养物，培养后胶塞密封，置－4O ℃冰箱中保存备用。

病死仔猪的组织培养物涂片染色镜检，均可见两端钝圆，多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰阴性短杆菌。

在丽江供电局的高度重视下，通过一系列改造措施后，丽江客户满意度持续提升，2017年、2018年连续两年国庆、春节未出现12398、95598投诉事件，甚至在今年极端天气雷暴大雨灾害中丽江古城内全面实现了“零停电”、故障“零报修”，无人员发生因大雨天气意外触电事件，截至目前未出现任何负面舆情现象，赢得了广大用电客户的一致好评。(杨绍豪 欧阳婷婷 田晓玲)

将待检菌株做成菌液涂片，用革兰染色法染色，选取在显微镜视野中显示为红色或粉红色的两端钝圆、两端浓染的中等大小的革兰阴性杆菌菌株进行生化鉴定。

1.2.3 菌株的生化鉴定

1.1.3 主要仪器设备

运用Python语言调用Arcpy制图模块实现同一空间中所有数据链接修复，无需打开地图文档即可自动更改数据链接。首先，对地图工程模板中的数据库进行替换并另存一个新的目标工程；然后，对新的地图工程文件进行数据修复。运用Python语言如下：

1.2.4 致病性试验

取120只体重18 g～22 g的健康小白鼠。挑取普通琼脂斜面上纯培养的菌落，接种于营养肉汤培养基中。随机选取60只小白鼠作为试验组，腹腔注射肉汤培养物0.1 mL/只；剩下的60只小白鼠作为对照组，腹腔注射肉汤0.1 mL/只，24 h～48 h内观察小鼠的死亡情况，取死亡或发病的小白鼠肝脏抹片，革兰染色、镜检，并取病料接种于麦康凯琼脂观察结果。

1.3 药敏试验

本药敏试验采用纸片琼脂扩散法。

2 试验结果

2.1 分离培养

在普通琼脂平皿板上长出表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起、中等大的菌落，直径2 mm～3 mm。在血液琼脂平板上长出菌落较大、边缘整齐并有隆起的灰白色菌落，多数不溶血。在麦康凯琼脂平板上生长出圆形、光滑、隆起、大小均一的红色菌落(中央颜色稍深)；普通肉汤呈均匀一致混浊状。

2.2 细菌形态学观察

1.2.2 镜检

2.3 动物致病力试验结果

在试验组60只小白鼠中，42只在24 h内死亡，16只在30 h死亡，另外2只发病；对照组小白鼠不发病。发病及死亡小白鼠的心血抹片经革兰染色镜检为革兰阴性中等小杆菌，将该心血接种于麦康凯琼脂培养基上均为红色菌落。

由于度量尺度不统一（up-to-scale）的原因，并不能使用双目三维重建同样的方法去处理多视图三维重建。引入透视N点法（Perspective N Point，PNP）将双目三维重建拓展到多视图重建三维场景。有很多关于透视N点法的研究，如P3P、P4P、P5P[19-20]等。但为了提高重构算法的鲁棒性，一般使用多于4个特征点的算法来解决实际应用中的问题。PNP算法大致通过求得前两幅图像中的特征点的三维坐标以及这些空间点在第三幅图像中的像素坐标位置来计算估计第三幅视图拍摄时的位置姿态。并类推到更多视图的三维重建。

2.4 生化鉴定结果

60株菌均能在三糖铁培养基上产酸产气，使培养基变黄，均不产生硫化氢，均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇。甲基红(methyl red，M-R)试验、吲哚试验为阳性。均不能利用柠檬酸盐，伏-波试验(voges-proskauer，V-P)试验阴性。根据生化特性，表明分离的菌为大肠杆菌(表1)。

2.5 药敏试验结果

2.5.1 60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株对16种抗生素的耐药情况

仔猪黄白痢大肠杆菌产生耐药性严重的抗生素依次为SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM、NOR、AMK、ENO、N、ERY、DOX、CFZ、PXB，其中耐药率大于或等于50%的9种抗生素，分别为SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM和NO；耐药率小于30%的抗生素有3种，分别为DOX、CFZ、PXB；结果见表2和图1。

2.5.2 60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株对16种抗生素的多重耐药情况

在课堂上我们利用微课小视频进行教学，在课后我们仍旧可以利用微课让学生巩固课堂知识。课堂的时间是有限的，我们在抓住课堂时间进行教学时，也需要让学生科学合理地利用课后时间，因为课后学习很多时候没有教师请教也没有同学讨论，这时候微课的价值就得到了充分的体现，学生可以根据自己的实际学习情况选择微课学习，在微课堂中讨论学习内容等。另外我们鼓励学生运用微课的同时，我们自己也要善于利用微课，让微课更好地服务学生、服务数学课堂。我们在教学过程当中可以通过微课不断学习优秀教师的教学方法，使其内化到自己的教学体系当中，从而更好地传授学生知识、引导学生学习，这样才能使课堂质效有更好的提升。

在60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株中，没有不耐药和仅耐1种、2种抗生素的分离菌株，对3种、4种、5种、8种、9种、10种、11种、13种和14种抗生素有耐药性的大肠杆菌分离株分别为2株、5株、4株、7株、3株、15株、11株、8株和5株，结果见图2。

2.5.3 60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株的耐药谱

60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株有45种耐药谱。4株分离株的耐药谱完全相同，大多数分离株都具有不同的耐药谱。主要的耐药谱见表3。

3 分析与讨论

3.1 60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株药敏试验及耐药谱分析

采用Kirby-Bauer法，60株仔猪黄白痢大肠杆菌分离株的药敏试验结果(图1)表明，在16种抗生素中，抑菌作用最强的是兽医临床上尚未使用或应用较少的头孢唑啉和多粘菌素，敏感菌株分别占90.0%(54/60)、90.0%(54/60)；其次为强力霉素、红霉素、新霉素和恩诺沙星，敏感菌株分别占73.3%(44/60)、70.0%(42/60)、68.3%(41/60)和63.3%(38/60)；而复方新诺明、氯霉素、链霉素、呋喃唑酮和氨苄青霉素等药物则表现出很高的耐药性，耐药率分别为88.3%、81.7%、78.3%、75.0%和73.3%；环丙沙星及诺氟沙星的耐药率也很高，分别为60.0%和56.7%。这与国内外有关文献大体吻合。马红霞等报道，大肠杆菌对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、呋喃妥因同时耐药的菌株已达半数；RolandLanz等报道猪(腹泻、水肿病)大肠杆菌分离株对庆大霉素、链霉素、壮观霉素、四环素、呋喃妥因的耐药性多见，对恩诺沙星的耐药率较高。

3.2 关于抗菌药物的使用方法

抗菌药物的选择应考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式，一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用，增加疗效：另一方面可以避免细菌长期与某一种药物接触，增加耐药性的产生概率。

建议停用已普遍产生耐药性和临床上已明显无效的药物，选用目前应用较少和经药敏试验证明对仔猪黄白痢大肠杆菌敏感的先锋霉素、多粘菌素、壮观霉素等药物。敏感药物的选择空间十分狭小，而研发新药又需要大量的人力、物力和财力，并且还有研制周期长、风险大等问题[3]，因此，开展联合应用抗菌药物的研究，充分发挥抗菌药物之间的协同作用，显得十分必要和迫切。

4 结论

随着抗生素在养猪生产中不断使用，耐药性菌株不断涌现，且出现的菌株多为对多种甚至是14种抗生素有耐药性，这些结果与杜银中、朱力军及马红霞等报道的基本一致。如果在生产中仍不加控制地使用抗生素，随着时间的推移，大肠杆菌的耐药率必将大幅度上升，多重耐药菌株将迅增，耐药谱增宽[4]，猪病的防治将面临严峻的挑战。因此，广大养猪生产者应严格遵守禁抗令，给动物生产营造一个科学的用药环境。