Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响

王大强，王革新，薛士鹏，张庆远，杜碧丽

近年来，我国冠心病等心血管疾病发病率呈升高趋势，目前药物治疗多数是通过扩张血管、抗凝、改善心肌重塑等改善心肌缺血，通过介入治疗、溶栓等促进血液流通，延长心肌细胞生存时间，恢复心肌功能，但由于心肌细胞防御功能未发挥或自身存在抵抗作用，较多病人治疗后疗效不佳[1]。有研究显示，通过基因手段可改善心肌细胞适应能力，减少由缺血引起的细胞凋亡，抑制心肌损伤，可能为预防和治疗心肌缺血研究的方向[2]。

Pitx2基因全名为paried-like homodmain transcription factor 2，其定位于4q25-26染色体上，Pitx2属于Bicoid家族成员，是一个转录因子，Pitx2和Pitx1、Pitx3共同构成了Pitx亚家族[3]。有研究表明，Pitx2在胚胎发育的眼睛周围、脐带、上下颌区域及四肢基部等部位表达，成人舌、脑、肺、肾等器官中也有Pitx2表达，Pitx2与左右不对称发育有关[4]。Pitx2突变引起多种疾病，如青光眼、角膜环状皮样瘤、乳腺癌等[5-7]。相关研究显示，Pitx2与心脏发育有关，敲除Pitx2可诱发小鼠心脏出现脂肪样组织，而获得Pitx2小鼠可免受缺血性心肌细胞损伤[8]。Pitx2缺陷的小鼠心尖部切除后不能及时修复，而增强Pitx2之后的小鼠心肌梗死后心肌组织再生能力明显增强，Pitx2具有保护心脏、促进心脏修复的作用[9]。目前关于Pitx2在缺氧诱导心肌细胞凋亡中的作用尚不明确。本研究以心肌细胞H9c2作为研究对象，探讨Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响及作用机制，以期为基因治疗和改善心肌缺血提供可能思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C-Caspase-3抗体、Pitx2抗体购自美国Abcam公司；Pitx2过表达载体、C/EBP同源蛋白(CHOP)过表达载体、阴性对照载体均由普健生物(武汉)科技有限公司提供；CHOP抗体、C-Caspase-12抗体购自美国Proteintech公司；心肌细胞H9c2购自通派(上海)生物科技有限公司；CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特；MR-96A酶标仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.2 细胞分组 心肌细胞培养条件为37 ℃，饱和湿度，5%CO2培养箱，细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，细胞传代培养以0.25%的胰蛋白酶消化进行传代培养。将心肌细胞分为4组，对照组：常规条件培养，为空白对照细胞；模型组：在实验开始时，进行缺氧复氧处理；Vector组：实验开始前24 h在细胞中转染阴性对照载体，实验开始时给予缺氧复氧处理；Pitx2组：实验开始前24 h在细胞中转染Pitx2过表达载体，实验开始时给予缺氧复氧处理。缺氧复氧处理方法：将细胞置于含有5%CO2、1%O2的37 ℃培养箱内培养。细胞转染方法按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000操作说明进行。

1.3 实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测Pitx2 mRNA 收集1.2方法处理24 h后的对照组、模型组、Vector组和Pitx2组细胞，将孔中的上清溶液弃掉后，吸取磷酸缓冲盐溶液(PBS)反复洗涤细胞2次，在细胞内添加Trizol试剂，常规方法提取细胞总RNA。冰浴条件下的EP管中添加1 μL的oligo dT、1 μL的random，添加ddH2O至12.5 μL，置于70 ℃孵育5 min后，置于冰上冷却2 min，之后再加入2 μL的dNTP、4 μL的5×Buffer、0.5 μL的RNasin、1 μL的M-MLV，均匀混合后，置于25 ℃温浴10 min，42 ℃温浴50 min，之后置于80 ℃孵育10 min，冰上冷却，得到的cDNA置于-20 ℃保存。PCR反应体系：1 μL的cDNA、10 μL的SYBR Green mastermix、0.5 μL的正向、反向引物，添加ddH2O至20 μL，PCR反应条件：94 ℃孵育5 min，94 ℃孵育10 s，60 ℃孵育20 s，72 ℃孵育30 s，共进行40个循环。Pitx2正向引物为5′-GGACCACCGCATCTCTACAT-3′，反向引物为5′-GACAGAAAGGAAAGCGCAAC-3′。

1.4 免疫印迹法检测Pitx2蛋白 收集1.2方法处理24 h后的对照组、模型组、Vector组和Pitx2组细胞，将孔中的上清溶液弃掉后，吸取PBS反复洗涤细胞2次，之后在细胞内添加放射免疫沉淀(RIPA)裂解溶液，晃动细胞培养板使裂解液完全覆盖细胞，置于冰上裂解20 min，期间采用移液枪吹打细胞4次。吸取裂解溶液并转移到离心管内，置于4 ℃低温离心机中，以12 000 g离心10 min。吸取上清溶液，分装并保存。采用2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)方法测定提取蛋白浓度。使用滤纸将洗净的玻璃板吸干，干燥后常规方法组装。使用浓度分别为10%分离胶和5%分离胶进行SDS-PAGE电泳，在蛋白中加入5×上样缓冲溶液，置于沸水浴中孵育5 min，制备成上样液。每个孔添加20 μL的上样液(含有30 μg蛋白)，连接电源，以80 V的恒定电压持续电泳3 h。电泳即将结束时，将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜提前浸泡在转移缓冲液中，按照“三明治”方法进行转膜，转膜电压调整为60 V，转膜进行1.5 h。将PVDF膜置于5%牛血清白蛋白溶液中，在室温下摇床震荡反应1 h。一抗和二抗使用前以封闭液稀释，Pitx2抗体按照1∶600稀释，内参3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体按照1∶1 000稀释，二抗按照1∶2 000稀释。将PVDF膜置于一抗孵育袋中，在室温中孵育结合2 h，之后将PVDF膜置于二抗孵育袋中，在室温中结合2 h。将提前混合好的电化学发光(ECL)试剂A和B混合物滴加到PVDF膜上，静置5 min。采用Image J分析条带的灰度值。Pitx2蛋白相对表达=Pitx2条带灰度值/GAPDH灰度值。

1.5 四唑盐(MTT)测定细胞增殖情况 将对照组、模型组、Vector组和Pitx2组心肌细胞按照每个孔4×103个细胞接种到96孔板内，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h。将培养箱取出，在每个孔内添加10 μL的MTT工作液，37 ℃孵育4 h。吸取孔内液体，再添加150 μL的二甲基亚砜(DMSO)溶液，使用酶标仪测定每个孔OD值。细胞存活率=(对照组OD值/实验组OD值)×100%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集按照1.2方法处理24 h后的对照组、模型组、Vector组和Pitx2组细胞，将孔中上清溶液弃掉后，吸取PBS反复洗涤细胞2次，添加胰蛋白酶，置于37 ℃消化1 min，1 000 g离心10 min，采用PBS将细胞悬浮，将细胞浓度调整至1×106个/mL。吸取1 mL细胞培养液，离心后取细胞沉淀，添加400 μL的结合缓冲溶液，之后再吸取5 μL的Annexin V-FITC和PI染色液添加到细胞内，避光条件下结合15 min。采用流式细胞仪检测凋亡变化。

1.7 免疫印迹法检测C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表达 收集1.2方法处理24 h后的对照组、模型组、Vector组和Pitx2组细胞，按照1.4中免疫印迹法步骤检测C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表达，C-Caspase-3、C-Caspase-12抗体按照1∶200稀释，CHOP抗体按照1∶400稀释。

1.8 CHOP过表达载体对上调Pitx2影响心肌细胞作用的测定 采用Lipofectamine 2000分别将CHOP过表达载体、Pitx2过表达载体和阴性对照载体、Pitx2过表达载体共转染到心肌细胞内，之后给予缺氧处理，作为Pitx2+CHOP组、Pitx2+NC组。细胞培养24 h后，MTT方法检测增殖细胞(步骤参照1.5)，流式细胞术检测凋亡细胞(步骤参照1.6)，免疫印迹法检测C-Caspase-3、C-Caspase-12、CHOP蛋白表达(步骤参照1.7)。

2 结 果

2.1 Pitx2过表达载体对缺氧诱导的心肌细胞中Pitx2表达的影响 与对照组比较，模型组心肌细胞Pitx2 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)；与Vector组比较，Pitx2组心肌细胞Pitx2 mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。提示Pitx2过表达载体提高缺氧条件下心肌细胞中Pitx2表达水平。详见图1、表1。

图1 Pitx2过表达载体转染后缺氧诱导的心肌细胞中Pitx2蛋白表达条带图

表1 Pitx2过表达载体转染后缺氧诱导的心肌细胞中Pitx2 mRNA和蛋白水平(±s)

2.2 上调Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响 与对照组比较，模型组心肌细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达水平均提高(P<0.05)；与Vector组比较，Pitx2组心肌细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，细胞C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达水平均降低(P<0.05)。提示上调Pitx2可提高缺氧条件下心肌细胞增殖能力，减少细胞凋亡。详见图2、表2。

图2 上调Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞凋亡和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达的影响(A为心肌细胞凋亡的流式细胞图；B为C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达条带图)

表2 上调Pitx2后缺氧诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达水平比较(±s)

2.3 上调Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞内质网应激相关蛋白CHOP表达影响 与对照组比较，模型组心肌细胞CHOP蛋白表达水平增高(P<0.05)；与Vector组比较，Pitx2组心肌细胞CHOP蛋白表达水平降低(P<0.05)。提示上调Pitx2抑制缺氧条件下心肌细胞CHOP表达。详见图3、表3。

图3 上调Pitx2对缺氧诱导的心肌细胞中CHOP蛋白表达影响的条带图

表3 上调Pitx2后缺氧诱导的心肌细胞CHOP蛋白水平比较(±s)

2.4 CHOP过表达载体对上调Pitx2的缺氧心肌细胞CHOP蛋白表达的影响 与Pitx2+NC组比较，Pitx2+CHOP组心肌细胞CHOP蛋白表达水平升高(P<0.001)。提示CHOP过表达载体促进Pitx2缺氧心肌细胞CHOP蛋白表达。详见图4、表4。

图4 CHOP和Pitx2过表达载体共转染对缺氧诱导的心肌细胞CHOP蛋白表达影响的条带图

表4 CHOP和Pitx2过表达载体共转染后缺氧诱导的心肌细胞CHOP蛋白水平比较(±s)

2.5 CHOP对上调Pitx2的缺氧心肌细胞增殖和凋亡影响 与Pitx2+NC组比较，Pitx2+CHOP组心肌细胞存活率降低，凋亡率升高，C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达增多(P<0.001)。提示上调CHOP可逆转Pitx2的保护作用。详见图5、表5。

图5 CHOP和Pitx2过表达载体共转染对缺氧诱导的心肌细胞凋亡和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达的影响(A为心肌细胞凋亡检测的流式细胞图；B为C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白表达的条带图)

表5 CHOP和Pitx2过表达载体共转染后缺氧诱导的心肌细胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、C-Caspase-12蛋白水平比较(±s)

3 讨 论

缺血性心脏病是临床常见的心血管系统疾病，缺血条件下，心肌细胞增殖能力降低，细胞凋亡增加，导致心肌组织完整性受损，引起心肌损伤，体外缺氧心肌细胞模型是常见的缺血心肌损伤的研究模型。缺氧条件下，细胞增殖能力降低，细胞凋亡水平升高[10]。本研究结果显示，缺氧处理后的心肌细胞存活率降低，细胞凋亡率增高，说明成功构建了缺氧心肌细胞损伤模型。

Pitx2是一种重要的转录因子，是Pitx家族中的成员之一[11]。Pitx2蛋白是同源域蛋白中与二倍体有关的一种亚类，Pitx2氨基酸残基在第三螺旋的第9个位置，在DNA和RNA结合中发挥着决定性作用，C端高度保守[12]。转录因子Pitx2在不同的物种中均有表达，与眼畸形、心血管畸形、垂体异常畸形等有关，在心脏、四肢、眼睛等器官发育中发挥着关键作用[13]。缺失Pitx2的小鼠出现明显的右心房异构且静脉回流受阻，肺组织及窦房结发育受到严重损害[8-9，14]。Pitx2功能增加后的成年小鼠心肌细胞心肌梗死后可再生[8]。敲除Pitx2后的小鼠出现心肌梗死，而恢复Pitx2可有效缓解成熟的心肌细胞免受缺血损伤[9]。Pitx2在心肌组织中发挥保护作用。本研究结果显示，缺氧处理后的心肌细胞Pitx2表达水平下调，而上调Pitx2可提高缺氧条件下心肌细胞增殖能力，减少细胞凋亡，表明Pitx2具有抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡作用，证实了Pitx2在缺氧心肌细胞中的作用。本研究结果与上述研究结果一致，说明Pitx2可能具有保护心肌组织缺氧损伤的作用。

缺氧诱导心肌细胞凋亡是造成缺血性心肌组织损伤的重要原因[15]。有研究表明，内质网应激在缺氧心肌细胞凋亡中发挥着作用[16]。内质网存在于真核细胞内，是与蛋白质折叠、应激反应等有关的细胞器之一，对缺氧、缺血、葡萄糖、ATP耗竭等应激刺激的敏感程度较高，一定程度的内质网应激可以改善内质网功能，而长时间、高强度的内质网应激则诱导细胞凋亡，导致组织损伤发生[17]。介导内质网应激细胞凋亡的关键调节因子之一为CHOP。CHOP是内质网应激中的转录因子，是碱性亮氨酸锌指结构蛋白样转录因子家族中的重要成员之一，在哺乳动物体内广泛存在[18]。机体受到外界因素刺激后，CHOP表达水平增加，内质网应激水平升高，CHOP又可激活Caspase-12，进而诱导Caspase级联反应发生，最终促进凋亡执行因子Caspase-3活化，促进细胞凋亡发生[19-20]。Caspase是与细胞凋亡有关的蛋白家族，其含有多个蛋白成员，分别位于Caspase凋亡反应的上游、中游和下游[21]。Caspase-12和Caspase-3均属于Caspase蛋白家族成员，在正常情况下多以无活性形式存在，只有被激活后形成C-Caspase-12、C-Caspase-3可诱导细胞凋亡的发生[22-23]。本研究结果显示，缺氧促进心肌细胞表达C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP，而上调Pitx2抑制C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白表达，说明上调Pitx2可激活缺氧条件下心肌细胞中内质网凋亡途径。同时结果显示，上调CHOP可逆转Pitx2的保护作用，证实了上调Pitx2影响心肌细胞凋亡，与CHOP有关。

综上所述，Pitx2在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中发挥着保护作用，Pitx2在缺血性心肌损伤中可能发挥抑制功能，Pitx2的作用机制与影响CHOP调控内质网应激有关。本研究未详细论述Pitx2通过何种直接或间接靶向机制影响CHOP表达，今后需进一步研究。