蓝莓表皮蜡质组分对果实采后抗病性的影响

张丽萍，刘瑞玲，韩延超，陈杭君，吴伟杰，房祥军，郜海燕

（浙江省农业科学院食品科学研究所 农业农村部果品产后处理重点实验室中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室 浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室 杭州 310021）

蓝莓（Vaccinium Spp），又称龙果、甸果、笃斯等，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium），内含黄酮醇、多酚、抗坏血酸、花青素等多种营养活性成分，具有抗氧化、改善视力等多种保健效用[1-2]。然而，蓝莓采后容易遭到病原微生物的侵害，严重影响果实的感官性状与营养品质，商品价值降低，导致极大的经济耗损。研究表明蓝莓果实采后主要致病菌为灰霉菌[3-4]。

成熟蓝莓果实表面覆盖有一层白色霜状蜡膜[5-6]。前期研究发现，外表皮蜡质受损的蓝莓对病原菌易感性增加，软化、衰老加速，采后腐烂率、病情指数上升，导致果实品质劣变，贮藏期缩短[6-9]。不同种类的蓝莓表皮蜡质晶体结构没有显著差异，为致密的管状蜡质[5]。蓝莓蜡质的组成成分相似，主要为三萜类物质和VLC 脂肪族类物质；其中熊果酸和齐墩果酸在许多蓝莓品种中占总蜡的50%以上，是蓝莓表皮蜡质中含量最高的三萜类化合物[10]。

不少研究发现角质层蜡质组分与果实病害之间有密切联系。Yin 等[11]指出，苹果梨表皮蜡质中的不同极性组分能够不同程度地抑制链格孢菌孢子及菌丝活性。Li 等[12]指出油酸甲酯、棕榈酸甲酯等可能是梨皮中的主要抗真菌物质。此外，角质层组分可作为信号分子参与宿主对病原微生物侵染的调控[13]。Fauth 等[14]发现角质单体可以作为H2O2激发剂，诱导植物体内产生H2O2以提高抗病性。Thomas 等[15]发现植物蜡质组分甾醇参与微生物与植物间的相互作用，在一定程度上抵御微生物侵染。然而，有关表皮蜡质组分对寄主防御体系与抗病能力的影响尚不清晰。

齐墩果酸与熊果酸均可抑制多种植物致病真菌生长。如：齐墩果酸能够抑制小麦赤霉病菌、白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌等的生长[16]。熊果酸能够抑制苹果赤星病菌[17]、柑橘青霉菌[18]等的生长。齐墩果酸与熊果酸均有较好的抗氧化效果[19-20]。作为蓝莓表皮蜡质的主要组分，二者极有可能参与果实抵御病原菌入侵的过程。本文用齐墩果酸与熊果酸分别处理蜡质完整与蜡质去除的蓝莓，研究蓝莓生理、生化指标的变化，探究蓝莓表皮蜡质中主要成分齐墩果酸与熊果酸在蓝莓果实抵御灰霉菌侵染过程中所起作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与处理 蓝莓：本试验用蓝莓品种为“粉蓝”，于新昌兆丰生态园蓝莓基地采收。采收时戴手套，小心保护果实表皮蜡膜。选择成熟度、大小相对均匀，无虫害、损伤，表皮蜡质完整的蓝莓果实。

将筛选后的蓝莓果实，随机分成6 组，用75%酒精喷洒消毒、晾干后进行如下处理：1）无菌水喷洒表面；2）250 mg/mL 齐墩果酸喷洒表面；3）250 mg/mL 熊果酸喷洒表面；4）蓝莓去除表皮蜡质，无菌水喷洒表面；5） 蓝莓去除表皮蜡质，250 mg/mL齐墩果酸喷洒表面；6） 蓝莓去除表皮蜡质，250 mg/mL 熊果酸喷洒表面。熊果酸与齐墩果酸处理浓度由前期预试验得出。

每个处理设置3 个生物学重复，每个重复用果50 颗，在室温下自然晾干，喷洒灰霉菌孢子悬浮液，晾干，放入25 ℃恒温箱中贮藏。设置6 个取样点，分别于0，2，4，6，8，10 d 取样，以液氮速冻，冻存于-50 ℃，测定相关指标。

去蜡处理：将50 颗蓝莓浸入50 mL 氯仿中振摇30 s，挥干溶剂。

灰霉菌：为实验室保藏菌株，从自然发病的“灿烂”蓝莓中分离获得。

1.1.2 试剂 熊果酸（UA）、齐墩果酸（OA），纯度＞95%，购于阿拉丁试剂公司。β-巯基乙醇、聚乙二醇、福林酚等均为国产分析纯级试剂。

1.2 仪器与设备

数码糖度计（PAL-1 型），日本ATAGO 公司；物性分析仪（TA XT Plus 型），英国SMS 公司；自动滴定仪（877 Titrino plus 型），瑞士万通；电子精密天平（JA260SB 型），上海精科天美科学仪器有限公司；紫外-可见分光光度计 （WFZ UV-2802型），尤尼柯仪器有限公司；高速低温离心机（5430R 型），德国EPPENDORF 公司；低温恒温培养箱（MIR-254-PC 型），日本PANASONIC 公司。

1.3 指标测定

1.3.1 可溶性固形物（TSS）与可滴定酸（TA） 将蓝莓果实挤压出汁，4 层纱布过滤。分别采用数显糖度计与自动酸碱滴定仪测定TSS 与TA，TA 结果换算为柠檬酸百分比（%）。

1.3.2 失重率与腐烂率 失重率为果实减轻质量占第0 天果实总质量的百分比（%）。腐烂率为腐烂果个数占总数的百分比（%）。

1.3.3 硬度 硬度由物性分析仪测定。选取P/2型不锈钢探头（d=0.2 cm），穿刺速度1.0 mm/s，下压距离0.8 cm，下压力5.0 g，取峰高力度作为硬度，单位为kg/cm2。试验重复10 次。

1.3.4 抗坏血酸（VC）、总酚与花色苷 VC 含量测定参考曹建康等[21]的方法，结果表示为100 g 蓝莓样品中含有的VC 的质量（mg），单位为mg/100 g。总酚含量测定参考Swain[22]的Folin-Ciocalteau法，结果表示为每1 g 蓝莓鲜样所含没食子酸的质量（mg），单位为mg/g。花色苷含量测定参考宋德群等[23]的方法，结果表示为每1 g 蓝莓样品所含矢车菊素-3-葡萄糖苷的质量（mg），单位为mg/g。

1.3.5 丙二醛 （MDA） MDA 含量的测定参考Heath 等[24]的方法，结果以每1 g 蓝莓鲜样中含有的MDA 物质的量表示，单位为nmol/g。

1.3.6 抗病相关酶活 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO），与β-1，3-葡聚糖酶（GLU）、几丁质酶（CHT）活力测定均参照曹建康等[21]的方法。

1.3.7 数据处理与分析 所有数据均采用Excel 2016 整理分析，采用SPSS Statistics 20 进行Duncan 方差分析与Person 相关性分析（P＜0.01 表示差异极显著；P＜0.05 表示差异显著）。采用Origin 2018 绘制图片，不同字母表示不同处理差异显著。

2 结果与讨论

2.1 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓病害程度的影响

蓝莓表皮蜡质与果实感官、营养等品质紧密相关[5]。如图1a 所示，除去表皮蜡质后蓝莓果实表皮呈现光滑的蓝黑色，更易受病原菌的侵染，发生腐烂、出汁、皱缩、霉变等现象，而齐墩果酸与熊果酸处理对蜡质完整果实与去蜡果实均能起到减少病害、维持品质的作用。如图1b 所示，第10 天，齐墩果酸组与熊果酸组分别比对照组低22.22%和23.46%。如图1c 所示，去蜡处理使果实腐烂率升高，去蜡组腐烂率最高，第10 天高达59.33%，而齐墩果酸与熊果酸处理后去蜡蓝莓腐烂率分别降低21.54%和27.55%，说明蜡质中的齐墩果酸与熊果酸能够提高果实抵御病原菌的能力，降低腐烂率。

图1 齐墩果酸与熊果酸对蜡质完整/去蜡蓝莓病害程度（a）、蜡质完整蓝莓腐烂率（b）和去蜡蓝莓腐烂率（c）的影响Fig.1 Effect of oleanolic acid and ursolic acid on diease degree of waxy intact / dewaxed blueberry （a），decay rate of waxy intact bluberry （b） and decay rate of dewaxed bluberry （c）

2.2 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓品质的影响

如图2a 所示，蓝莓持续失重，去蜡蓝莓失重率高，齐墩果酸处理与熊果酸处理能够大幅减缓果实失重率的升高。这与对欧洲李[25]、柑橘[26]等果实中的研究结果一致。贮藏第10 天时，对照组、齐墩果酸组、熊果酸组、去蜡组、去蜡+齐墩果酸组与去蜡+熊果酸组失重率分别为7.41%，4.90%，5.63%，7.81%，6.18%，7.04%。类似的，Parsons 等[27]对辣椒失水与角质层组分的关系的研究表明：失水率与总三萜加甾醇含量呈正相关，与烷烃与三萜加甾醇比值呈负相关。综上，蓝莓表皮蜡质组分中的齐墩果酸与熊果酸有防止水分散失作用，利于果实品质保持。

硬度可以直观反映果实发生衰老、软化和劣变的程度。从图2b 可以看出贮藏期蓝莓果实硬度轻微下降，去除蜡质后硬度略有降低，且齐墩果酸组与熊果酸组果实硬度略低于无菌水处理组，差别并不显著（P＞0.05），说明蓝莓表皮蜡质中的齐墩果酸与熊果酸对延缓果实硬度降低不明显。

可滴定酸（TA）能够间接说明果实劣变程度。由图2c 可看出，蓝莓TA 含量呈上升趋势，尤其去蜡果实在第4 天后TA 急速上升。蜡质受损后，蓝莓对病原菌易感性增大，急剧代谢产酸；而齐墩果酸与熊果酸处理后，延缓了果实TA 含量的升高，并显著低于无菌水处理。上述结果说明在病原菌侵染过程中，齐墩果酸与熊果酸处理可以减缓TA升高。

可溶性固形物（TSS）能够体现果蔬的成熟及质量情况。由图2d 所示，蓝莓果实去除表皮蜡质后，对病原菌易感性增加，糖类等物质消耗代谢为TSS，TSS 保持较高水平，然而很快又被消耗，迅速降低。而齐墩果酸与熊果酸处理能够调控果实代谢系统，增加果实抗病能力，降低病原菌的破坏程度，延缓TSS 降低，因此TSS 含量高于无菌水处理。综上，蓝莓表皮蜡质中的齐墩果酸与熊果酸在维持果实TSS 中起重要作用。

图2 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实失重率（a）、硬度（b）、TA（c）和TSS（d）的影响Fig.2 Effects of oleanolic acid and ursolic acid on weight loss （a），firmness （b），TA（c） and TSS （d） of blueberry

2.3 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓活性物质的影响

蓝莓果实内存在多种多酚类物质，可控制病原菌分泌的酶类活性物质，其氧化产物具有抗菌作用，是果实体内重要防御素之一[28-29]。由图3a 可知，除去蜡组外，其余组总酚含量在贮藏前期均有所上升；去蜡+齐墩果酸组与去蜡+熊果酸组始终显著高于去蜡组（P＜0.05），齐墩果酸组和熊果酸组均高于对照组。这可能是因为蜡质中的齐墩果酸与熊果酸能够产生信号以调控酚类物质，抵御灰霉菌侵染。综上，齐墩果酸与熊果酸可以诱导蓝莓果实酚类物质变化，抵御病原菌侵染。

抗坏血酸（VC）是果实内清除活性氧的一种重要的抗氧化剂[30]。在果蔬受到微生物胁迫时，活性氧爆发，VC 能够维持其活性氧代谢平衡。如图3b 所示，去蜡蓝莓果实VC 含量远低于蜡完好的蓝莓果实。其中，熊果酸组去蜡+熊果酸组VC 含量显著比对照组高（P＜0.05），而对照组与熊果酸组、去蜡组与去蜡+熊果酸组并无显著性差异（P＞0.05）。可见，表皮蜡质受损加速蓝莓VC 流失，熊果酸利于VC 含量的保持，而齐墩果酸对VC 含量的影响不显著。

图3c 反映蓝莓贮藏期间总花色苷含量的变化情况。去蜡果实花色苷含量在第2 天急剧降低。贮藏期间，齐墩果酸组始终显著比对照组高（P＜0.05）。去蜡+齐墩果酸组始终高于去蜡组，并不显著（P＞0.05）。熊果酸处理的果实，花色苷含量变化无明显规律。推测可能是齐墩果酸与其它蜡质组分协同调控蓝莓花色苷，而熊果酸对花色苷影响并不显著。

图3 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实总酚（a）、抗坏血酸（b）和花色苷（c）的影响Fig.3 Effects of oleanolic acid and ursolic acid on total phenols （a），ascorbic acid （b）and anthocyanins （c） of blueberry

2.4 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓膜脂过氧化的影响

丙二醛（MDA）可以反映果实细胞膜脂过氧化与膜结构被破坏的程度[31]。由于病原菌的侵染以及成熟衰老的进行，蓝莓中MDA 含量不断上升，如图4所示。其中，蜡质受损果实更易发生劣变，MDA 大量积累。与无菌水处理相比，熊果酸与齐墩果酸处理能够有效减缓MDA 的升高。第10 天时，对照组、齐墩果酸组、熊果酸组、去蜡组、去蜡+齐墩果酸组、去蜡+熊果酸组MDA 含量分别为4.80，3.69，2.91，9.90，6.10，6.61 nmol/g，齐墩果酸组、熊果酸组显著比对照组低（P＜0.05），去蜡+齐墩果酸组、去蜡+熊果酸组显著比去蜡组低（P＜0.05）。结果表明，齐墩果酸与熊果酸能够抑制蓝莓细胞膜脂过氧化，降低MDA 的含量。

图4 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实MDA 的影响Fig.4 Effect of oleanolic acid and ursolic acid on MDA of blueberry

2.5 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓抗病相关酶活的影响

2.5.1 多酚氧化酶（PPO）与过氧化物酶（POD） PPO 能够催化酚类物质氧化生成醌类化合物，抑制病原菌分泌果胶和纤维素分解酶，降低果实病害程度[29]。如图5a 所示，PPO 活性前期呈现上升趋势，后期呈下降趋势。蜡质完整的蓝莓PPO 酶活显著高于去蜡蓝莓（P＜0.05）。齐墩果酸与熊果酸处理的果实PPO 酶活显著高于相应无菌水处理的果实（P＜0.05）。说明蜡质中的齐墩果酸与熊果酸能够调控寄主的PPO 活性，从而提高果实抗病性。

POD 在果蔬组织受到病原微生物侵染时做出相应的应答反应[28]。蓝莓POD 活性变化如图5b 所示，蜡质完整的3 组果实前期上升、后期下降，而去除蜡质的3 组果实POD 活性持续下降。齐墩果酸与熊果酸处理能够提高果实POD 酶活；第10天，齐墩果酸组与熊果酸组比对照组分别高75.17%和125.65%，去蜡+齐墩果酸组与去蜡+熊果酸组比去蜡组分别高133.61%和197.48%。推测蜡质中的齐墩果酸与熊果酸能够激发果实POD的应答反应。

图5 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实PPO（a）与POD（b）酶活的影响Fig.5 Effects of oleanolic acid and ursolic acid on PPO （a） and POD （b） activities of blueberry

2.5.2 几丁质酶（CHT）与β-1，3-葡聚糖酶（GLU） CHT 广泛存在于果蔬体内，通过降解几丁质破坏病原真菌的细胞壁，来增强果蔬抗病害能力[32]。由图6a 可知，前期，去蜡+齐墩果酸与去蜡+熊果酸两组CHT 活性迅速升高，未去除蜡质的3 组果实CHT 活性差别不大；后期，齐墩果酸组显著高于去蜡组（P＜0.05），去蜡+齐墩果酸组与去蜡+熊果酸组CHT 活性始终高于对照组，而熊果酸组波动较大。这说明灰霉侵染过程中，蜡质组分中的齐墩果酸与熊果酸不同程度地参与CHT 的调控。

GLU 与果蔬采后抗病性有密切联系，许多非生物因子及生物因子都能诱导GLU 活性的变化[32]。如图6b 所示，GLU 活性整体呈前期升高后期降低的趋势，且去蜡的3 组果实高于蜡质完整的3 组果实。第4 天后，齐墩果酸组、熊果酸组始终显著高于对照组（P＜0.05），去蜡+齐墩果酸组、去蜡+熊果酸组GLU 活性始终显著高于去蜡组（P＜0.05）。说明蜡质中的齐墩果酸与熊果酸在果实抵御病原菌侵染过程中与诱导GLU 活性升高有关。

图6 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实CHT（a）与GLU（b）酶活的影响Fig.6 Effects of oleanolic acid and ursolic acid on CHT （a） and GLU （b） activities of blueberry

2.5.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL） PAL 与植物抵御病原微生物侵害的能力有重要联系[33]。由图7可知，在侵染过程中，由于果实衰老、腐烂严重，去除蜡质的3 组蓝莓果实的PAL 活性始终低于表皮蜡质完整的3 组蓝莓果实。后期齐墩果酸与熊果酸处理的果实PAL 活性均高于相应无菌水处理的果实。其中，第6 天，去蜡+熊果酸组PAL 酶活显著比去蜡组高（P＜0.05）。第8 天，熊果酸组显著比对照组高（P＜0.05）。在第6、10 天，齐墩果酸组PAL 酶的活性显著比对照组高（P＜0.05）。第8 天，去蜡+齐墩果酸组显著高于去蜡组 （P＜0.05）。可见，齐墩果酸与熊果酸均能诱导PAL 活性升高，二者诱导效果并不显著。

图7 齐墩果酸与熊果酸对蓝莓果实PAL 酶活的影响Fig.7 Effect of oleanolic acid and ursolic acid on PAL activities of blueberry

2.6 相关性分析

Person 相关性分析表明蓝莓果实的腐烂率与失重率、TA 含量、MDA 含量呈极显著正相关（P＜0.01），与硬度呈显著负相关（P＜0.05），与TSS、VC、总酚、花色苷呈极显著负相关（P＜0.01），说明病原菌侵染是导致蓝莓果实细胞膜脂过氧化、营养物质流失、质量下降的重要原因。

此外，腐烂率与蓝莓果实的CHT 活性呈极显著正相关（P＜0.01），与PPO 活性、POD 活性、PAL活性呈极显著负相关（P＜0.01），说明在宿主抵御病原物侵染过程中，PPO、POD、PAL、CHT 等酶发生应答反应，以应对生物胁迫。蓝莓果实去蜡后，不仅物理屏障被破坏，而且可能丧失了蜡质组分中的信号分子，导致更容易受到灰霉菌孢子的影响，诱导防御体系发生应答反应。而蓝莓表皮蜡质中的齐墩果酸与熊果酸极有可能是作为一种信号分子，诱导调控蓝莓果实相关抗病酶活，以提高果实抗病能力。Chu 等[34]研究表明贮藏过程中蓝莓表皮蜡质中三萜类化合物含量从68.69%上升到73.67%，其中熊果酸的相对含量明显增多，这可能与果实激活体内防御系统、抵御病原菌侵染有关。

图8 相关性分析Fig.8 Correlation analysis

3 结论

去除蓝莓表皮覆盖着的白色蜡膜后，果实更易受到灰霉菌的侵染，腐烂率、TA、失重率等升高，TSS、VC、总酚、总花色苷等降低，极大地影响果实的商品价值。而齐墩果酸与熊果酸能够在灰霉菌侵染过程中诱导果实应答反应，对防御酶活（PPO、POD、PAL、CHT、GLU） 的激活起到积极作用，提高果实抗病能力，减缓果实劣变。同时，齐墩果酸与熊果酸能够降低果实膜脂过氧化程度（MDA），维持果实品质（TSS、TA、硬度、发病率、失重率）与活性物质（VC、总酚、总花色苷）。由此说明，外表皮蜡质与蓝莓果实抗病性有重要联系，蜡质中的齐墩果酸与熊果酸对提高蓝莓果实采后抗病性，维持果实品质有重要作用。然而，有关蓝莓外表皮蜡质中的齐墩果酸与熊果酸影响果实防御应答反应机理还需进一步研究。