低温等离子体活化水在食品杀菌保鲜中的应用

唐 林，王 松，郭柯宇，杨 勇，2，刘书亮，2*，郭洪祥

（1 四川农业大学 食品学院 四川雅安625014）2 四川农业大学食品加工与安全研究所 四川雅安625014）3 四川金忠食品有限公司 四川邛崃 611500）

等离子体（plasma）是由几种激发的原子、分子、离子和自由基组成，与多种反应性物种和电磁辐射的能量共存[1]。根据带电粒子温度的不同，可分为高温等离子体和低温等离子体。低温等离子体能够在接近环境温度下（30～60 ℃）产生大量生物活性物质，如活性氧（ROS）和活性氮（RNS）[2]，具有非热力消毒和表面改性作用，且不含有毒化学物质，对环境无害。直接将气体等离子体施加于食品上，可以获得最大的微生物灭活效率，然而有研究认为，电场和带电粒子、紫外线、电子等特定物理物质会对污染表面造成直接等离子体损伤[3]。一些食品表面的生物活性化合物在等离子体直接处理后也会被降解，产生负面影响，例如：颜色、表面形貌变化和热敏性损伤等；天然食品原料成分复杂、不均一以及形状不规则等，低温等离子体技术在处理均匀度等方面尚欠缺。

等离子体活化水 （Plasma activated water，PAW），又称为等离子体酸、等离子体活化液体[4]，是指水被低温等离子体处理后，水分子离解的产物与等离子体中的活性物质反应产生富含更多种类活性成分的水溶液。PAW 作为一种新型的杀菌保鲜剂，由于其较好的流动性和渗透性被广泛应用于消毒杀菌、果蔬保鲜、器械表面去污和废水净化等生活中的各个领域。本文就PAW 的产生装置、理化性质、杀菌机理和效果以及在食品杀菌保鲜中的应用进行综述，旨在为其广泛应用提供参考。

1 低温等离子体活化水的产生装置

理论上讲，能产生低温等离子体的方式都可产生PAW，在食品工业中常见的按照放电结构分类有介质阻挡放电（DBD）、大气压等离子体射流（APPJ）和滑动电弧放电等（见表1）。等离子体微射流（PMJ，表中未显示）是指特征尺寸在1 mm 之下的大气压等离子体射流，因其较小的特征尺寸，可直接处理一些微型物体，在食品工业中也有应用。不同装置的结构和特点各不相同，如SDBD 只能水上放电产生PAW，而APPJ 和DBD 既能通过水上放电也能通过水下放电激活液体。目前还未有研究比较在一定条件下不同装置产生的PAW理化性质的差异，因此，我们在此只探讨了不同PAW 产生装置的特点。

表1 低温等离子体活化水常见产生装置及特点Table 1 Common low-temperature plasma activated water generating device and characteristics

2 低温等离子体活化水的理化性质

PAW 的理化性质以及主要的活性氧和氮物种（RONS）在很大程度上取决于等离子体气态产物，而气态产物又强烈依赖于放电方式、工作气体和放电功率[7]。Tian 等[8]比较了放电方式对PAW 理化特性和生物学效应的影响，结果表明，水下放电的杀菌效率强于水上放电，因为水下放电诱导了严重的氧化应激，导致细胞内更多的ROS 积累。且水下放电产生的PAW 氧化还原电位和电导率更高，这可能是由于相比于液体，大气的击穿强度、密度和电导率较低。工作气体的成分对等离子体气态产物有很大影响，PAW 中高浓度的H2O2与氩气放电和等离子体中的电子能量[9]有关，在氩等离子体中，高能电子、激发的氩原子和离子主要负责H2O 的离解和H2O2的形成[10]，因此纯氩的工作气体有利于H2O2的形成。而用空气作为工作气体则有助于形成氮氧化物，Lai 等[9]用Ar 或者Ar+ 1% O2混合气体作为工作气体，产生的NO2-和NO3-浓度接近或低于仪器检测极限，用空气作为工作气体则可促进NO2-的产生，说明N 原子的存在对NO2-和NO3-的形成至关重要。放电功率和电压主要决定羟基自由基的形成，Van 等[11]解释了所有吸附的OH 自由基都会转化为H2O2，在气相中形成的H2O2也会被运输到处理液中，增加PAW中H2O2的浓度。另外，激活时间也会影响PAW 的理化性质和RONS 种类，PAW 的pH 值会随着活化时间的增加而降低，活化10～20 min 后，溶液的pH 值一般下降到2～3 左右[3，12]。但使用不同的工作气体对pH 值有一定影响，研究证实等离子体造成的水溶液酸化主要与其产生的NO 衍生物NO2-、NO3-和ONOO-等含氮物质有关[13]。而PAW的氧化还原电位（ORP）、电导率、H2O2值、NO2-和NO3-浓度在一定范围内都会随着活化时间的延长而增加[14]。

3 低温等离子体活化水的杀菌机理及效果

3.1 PAW 的杀菌机理

在等离子体活化水的过程中，会产生长寿命的RONS，如H2O2、NO2-和NO3-，也会产生一些短寿命的RONS，如·OH、HOO·、O2·-和ONOO-。等离子体暴露于水中后产生的RONS 被认为是PAW中破坏细菌的关键成分，其中主要的反应性物种和形成机理如图1所示。活性氧是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，包括·OH、H2O2、O3、单线态氧（1O2）和O2·-等。ROS 通常被认为是主要的杀菌剂，可以破坏肽聚糖的分子内键，导致细胞壁破裂[4]，引起微生物细胞膜的氧化应激，改变细菌的表面结构和化学状态，然后进入细胞内导致DNA分解、蛋白质破坏及其它内部成分的损伤[15]。活性氮是指以NO 为中心的衍生物，包括NO2、NO2-和NO3-等，它们能在水溶液中形成HNO2、HNO3导致水溶液酸化，使微生物失活。RNS 对微生物的灭活作用主要是通过降低PAW 的pH 值。PAW 的临界pH 值约为4.7，高于此pH 值则杀菌效果较弱，低于此pH 值则杀菌效果明显变强。临界pH 值可能来自超氧阴离子自由基（O2·-）与过氧化氢自由基（HOO·）之间平衡反应的pKa，约为4.8[16]。

图1 等离子体活化水产生过程中的主要反应性物种和形成机理Fig.1 The main reactive species and formation mechanism in the process of plasma activated water production

基于ROS 和RNS 的物质可能在PAW 的灭菌过程中起重要的协同作用。有研究表明，单独的NOx 和H2O2都不能有效使溶液中的细菌失活[16]，纯酸性环境也几乎没有降低孢子的生存能力[14]，只有NO2-和NO3-以及H2O2在酸性条件下的协同作用才能产生强大的杀菌活性，这种协同作用大概是由于过氧亚硝酸（ONOOH）、过氧亚硝酸盐和相关的氮氧化物产物的形成[17]。ONOOH 是一种非常强的氧化剂，与活细胞膜存在脂质反应，有很多研究已经证实了ONOOH 的抗菌活性，但由于寿命短和其它反应性物质的干扰目前很少有研究对它进行量化。最新的研究首次发现由于PAW 中ONOOH 浓度太低而无法实现完全杀菌作用。实际上，ONOOH 与H2O2进一步相互作用生成的过氧硝酸（O2NOOH），最终分解为O2·-和1O2，这两种物质大大增强了PAW 的杀菌作用[18]。这与Ikawa等[19]的研究结果一致，PAW 中具有杀菌作用的物质不是ONOOH，也不是游离的反应性氧，而是释放O2·-的含氮原子的分子O2NOOH。

3.2 PAW 对食品中常见微生物的灭活效果

食品中常见的致病菌有沙门氏菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等，它们能以浮游、附着以及生物膜的形式存在于各种食品及环境中。PAW 对多种微生物均具有良好的抗菌活性，包括细菌、真菌、孢子、细菌生物膜以及病毒[20]等。不同类型的微生物对PAW 的敏感性不同，酵母和真菌比细菌的耐受性更强[6]，因为原核细胞比真核细胞具有更高的表面积/体积比，从而增加了这些细胞中RONS 的浓度。G+比G-耐受性更强，可能是因为G+肽聚糖结构相对致密，敏感性相对较低。表2总结了近年来文献中PAW 对食品中常见致病菌的浮游细胞和黏附细胞灭活的效果。无论是浮游细胞还是附着细胞，PAW 都能有效地灭活[21]。其它条件一定时，贴壁细菌的灭活效果不如浮游细菌，这可能是因为细胞在黏附过程中性能有所改变。PAW 对贴壁细胞的灭活作用既依赖于菌株，也依赖于所黏附的固体基质，还依赖于细胞对材料的初始黏附水平。表中PAW 对浮游细胞的灭活效果仅代表在纯培养物的情况下，不能完全代表在实际生产中的灭活效果。在实际生产过程中，既要求杀灭环境和加工器械表面黏附的微生物，又要求保持材料表面的完整性。已有研究证明PAW 能有效灭活黏附于不锈钢和高密度聚乙烯上的微生物，且不会对被污染材料表面造成任何影响[6]。因此，PAW 与使用刺激性化学消毒剂（如含氯化合物、过氧乙酸等）的常规消毒方法相比，不会造成有害物质的残留和器械表面的损害，对环境的影响小且对微生物细胞的损伤强，在食品工业中有替代传统消毒方法的潜力。但目前来看，将PAW 应用于食品工业生产环境消毒的研究几乎还没有，对生产车间接触面、空气、地面、水体以及管道等的消毒也还未涉及。

考参献文[22][23][24][25][26][27][28][29][14][30][31][32][33][34][21][35][36][37][38][39][40][41]-1）/lg （CFU·mL 率活灭-1）lg （CFU·g或5.30和，3.43 1.54 2.10～5.50 1.62～2.96、0.6 0.2 0.49 2.00 0.77 4.40和，3.79，2.16 1.02，3.98 3.75 4.20，4.88，＞5，＞5，＞5＞5＞5，2.32 3.70 4.13，0.58，＞2，4，3.6＞7 5.5，3.90，0.86，7.10，7.00，6.58 5.91，5.73，4.73，4.07/5.25，5.12，4.45，3.22/6.56，5.64，3.98，3.44，5.36 /，3.16 1.84，5.90，4.35 2.20＞6 3.53和，2.51 1.27 4.41 0.59，0.72＞5 4.8果效活灭的物生微见常中品食对PAW 2表Inactivation effect of PAW on common microorganisms in food Table 2 间时理处间时化活置装生产PAW式形在存类种物生微6 min 90 s和，60 30 APPJ胞细游浮（Pseudomonas deceptionensis菌 CM2胞单假）CM2 10 min 10 min和5 PMJ胞细游浮）（Staphylococcus aureus菌球萄葡色黄金60 min 60 s APPJ胞细游浮）（Bacillus cereus spores菌杆孢芽样蜡，24 h 2 20 min SDBD胞细游浮）（Aspergillus flavus Spores子孢霉曲黄-120 s PMJ胞细游浮）（Saccharomyces cerevisiae母酵酒酿5 min 30 min 列阵体子离等微胞细游浮（Shewanella putrefaciens）菌氏瓦希败腐8 min 60 s APPJ胞细游浮）：H7（Escherichia coli O157：H7 O157菌杆肠大-30 min和，20，10 5-胞细游浮）（Escherichia coli菌杆肠大，30 min 10-APPJ胞细游浮）（Colletotrichum gloeosporioides菌疽炭孢球10，15，20 min 30 min-胞细游浮菌球萄葡色黄金，20 min，15 10 30 min胞细游浮菌杆肠大1 min 30 min胞细游浮）（Pseudomonas aeruginosa菌胞单假绿铜15 min 60 s APPJ胞细游浮菌球萄葡色黄、金：H7 O157菌杆肠大1 min-电放弧电动滑胞细游浮（Listeria monocy-菌特斯O157：H7、李菌杆肠大togenes）15 min 20 min PMJ胞细游浮、菌杆肠）、大（Streptococcus mutans菌球链形变）（Candida albicans菌珠念色、白菌球萄葡色黄金1 h 5 min APPJ 胞细游浮黄（Listeria innocua）、金菌特斯李害、无菌杆肠大（Aeromonas hy-菌胞单气水、嗜菌球萄葡色（Pseudomonas fluo-菌胞单假光drophila）、荧菌氏瓦希败rescens）、腐10 min 5 min 电放弧电动滑/黏钢锈不于附/黏胞细游浮膜（Hafnia alvei）、肠菌亚尼夫哈房、蜂母酵酒酿（HDPE）烯乙聚度密高于附萄葡皮（Leuconostoc mesenteroides）、表菌珠串明（Staphylococcus epidermidis）菌球30 min和，20 10 5 min电放弧电动滑于附黏/钢锈不于附黏菌亚尼夫哈房蜂HDPE 15 s—DBD钢锈不于附黏）（Clostridium difficile菌梭难艰15 min 10 min和，7 3 APPJ果坚于附黏）（Klebsiella pneumoniae菌伯雷克炎肺20 min 60 s APPJ壳蛋于附黏）（Salmonella菌氏门沙30，60 min 60 s APPJ 稻水于附黏菌杆孢芽样蜡5 s 15 s DBD上手于附黏菌杆肠大30 min 60 min列阵体子离等微膜物生菌球萄葡色黄金

4 低温等离子体活化水在食品保鲜中的应用

4.1 在果蔬保鲜中的应用

为了确保微生物安全，并对处理食品的感官和营养品质的负面影响降到最低，许多研究都集中在非热技术上，如高压、脉冲电场、超声波和非热等离子体技术等[3]。PAW 是目前一种相对较新颖的生鲜食品保鲜方法，从表3可以看出，通过PAW 浸泡、漂洗或喷洒果蔬，能有效杀灭果蔬表面微生物，保持果蔬硬度，延缓腐败变质，且对果蔬的颜色和可溶性固形物含量等理化品质造成的负面影响较小。同时，鲜切果蔬由于切割加工后组织内的酶与底物的区域化结构被破坏，极易褐变影响品质，Liu 等[42]的研究表明PAW 处理可减少鲜切苹果的浅褐色，在PAW 处理组和对照组之间也没有观察到抗氧化剂含量和自由基清除活性的显著变化。Zhao 等[43]的研究也表明PAW 处理增强了鲜切猕猴桃中抗氧化酶的活性，提高了细胞内ROS 的清除能力，有助于控制氧化损伤和脂质过氧化，延长鲜切猕猴桃的货架期。PAW 不仅能保鲜果蔬，还能在一定程度上降低农作物中的霉菌毒素和农药残留，如发芽大麦中镰刀菌产生的脱氧雪腐烯醇[44]和葡萄中的辛硫磷残留[45]，因为PAW 的酸性环境（pH＜3）和高氧化能力（ORP＞500 mV）有利于辛硫磷的减少。因此，PAW 有希望成为一种绿色的果蔬保鲜剂或清洗剂，但同时也应考虑新鲜果蔬或鲜切果蔬被PAW 浸泡和漂洗后一些生理特性（如呼吸和后熟作用）和可溶性物质的变化。

表3 PAW 在果蔬保鲜中的应用Table 3 Application of PAW in the preservation of fruits and vegetables

4.2 在肉类保鲜中的应用

PAW 在肉类中的应用主要是肉类护色和肉类保鲜方面。肉类腌制通常会在新鲜的肉块中添加NaNO2，起到发色、抑制脂质过氧化、控制腐败和病原微生物生长的作用。低温等离子体可以与水发生反应形成NO2、N2O3和N2O5等活性氮氧化物，这些活性物质能与水分子结合成硝酸盐或亚硝酸盐，Jung 等[51]的研究表明空气等离子体活化的盐水溶液已经含有足够的亚硝酸盐，可用作腌制的亚硝酸源，腌制的效果与添加亚硝酸盐的处理组类似且脂质过氧化值无明显差异，但前者亚硝酸盐残留量更低。这与Yong 等[52]的研究结果一致，等离子体处理水可增加肉品红度值，同时保持较低的残余亚硝酸盐含量和细菌总数，脂质过氧化值也没有明显差异，且等离子体处理水制造的里昂火腿通过致突变试验未显示出遗传毒性。Kim等[53]也对等离子处理水作为亚硝酸盐源处理肉制品的安全性做了研究，发现经等离子处理水生产的乳化液型香肠不存在致突变性和免疫毒性。因此，在不影响肉品质量的情况下，PAW 可作为一种潜在的亚硝酸盐替代品。

PAW 在肉类保鲜方面的应用主要是抑制腐败和病原微生物生长，Zhao 等[54]通过PAW 喷洒牛肉，发现鲜切牛肉表面的细菌在储存24 d 时比对照少3.1 个对数值左右，并可以较好的保持鲜切牛肉的pH 值、挥发性盐基氮值、硫代巴比妥酸值、弹性值和硬度，从而有效延长鲜牛肉的保质期4～6 d。同时，PAW 也由于含有ROS 等强氧化性物质会对肉类的颜色以及脂肪氧化产生不良影响。鲜牛肉经过PAW 处理后a*值先增加后下降，这可能是由于脱氧肌红蛋白氧化，在冷藏过程中转化为鲜红色的氧肌红蛋白，而a*值的下降则是因为经过PAW 处理后肉表面的pH 值显著下降。Kang 等[55]发现PAW 处理鸡肉后也会导致颜色变化，引起L*值升高、a*值和b*值降低，但硬度、弹性等质构特性无明显变化，这与Royintarat 等[56]的研究结果一致。但用PAW 冰来保鲜海产品时，则可减轻对色泽的不利影响，Liao 等[57]用PAW 冰来保鲜虾类产品，发现与自来水冰相比，PAW 冰在抑制微生物生长方面具有显著优势，可延长贮藏时间4～8 d。经PAW 冰处理的虾在贮藏过程中pH值保持在7.7 以下，可以减缓L*值的降低和a*值峰值的出现，延迟虾黑变病的发展和硬度的变化，使挥发性盐基氮的产量降低。焦浈等[58]通过研究PAW 冰对接种于三文鱼表面单增李斯特菌的杀菌效果，发现PAW 冰可以有效抑制染菌三文鱼片表面单增李斯特菌生长并减缓三文鱼片挥发性盐基氮值和pH 值上升。因此，PAW 冰有潜力作为未来海鲜保鲜的一种替代方法。目前，关于PAW 用于畜禽肉类产品保鲜中的研究还比较少，PAW 引起肉类颜色变化、蛋白质和脂质氧化等的机理也不够清晰，如果想进一步将PAW 应用于肉类保鲜，应加大PAW 中影响肉类品质物种的研究并寻找能够减轻PAW 对肉类产生负面影响的方法。

表4 等离子体活化水在肉类护色与保鲜中的应用Table 4 Application of plasma activated water in meat color preservation and preservation

5 结论

等离子体活化水相比于直接等离子体处理更加温和，通过水为介质避免了带电粒子、紫外线和电子等特定物质对脆弱的污染表面造成的直接等离子体损伤，同时它是以液体形式存在，使用更加方便灵活。它可以直接利用空气作为工作气体，蒸馏水作为活化液体产生，成本低廉，不会产生二次污染而在食品工业中有着广阔的应用前景。PAW的杀菌作用来自于ROS 和RNS 的协同作用，其中O2NOOH 被认为是主要的杀菌物质，最终可分解为O2·-和1O2从而大大增强杀菌效果。但主要活性物质（O2·-和1O2）的寿命非常短，这可能成为PAW杀菌活性的主要限制。同时，水溶液的等离子体处理能产生H2O2，NO3-，NO2-和一些自由基等，这些化学物质是否可能影响食品安全仍是一个需要探讨的问题。另外，PAW 在肉及肉制品的杀菌保鲜，以及对肉制品感官品质和理化品质的影响方面研究甚少，仅有的几篇文献表明PAW 应用于肉制品可能会对其色泽和脂肪产生不利的影响，但并未提及到减轻PAW 对肉类品质影响的方法。

在未来的研究中，首先要进行PAW 的安全性评估，在充分利用这种消毒技术之前，有必要对PAW 中活性氧化剂的产生和其潜在的毒理学作用进行全面评估；其次应对PAW 中短寿命活性物质的降解动力学进行研究，为尽可能保持其活性和发挥最大抗菌作用提供依据；还应优化PAW 产生条件，比较不同装置产生PAW 理化性质的差异，开发更多种类的处理溶液，以获得更好抗菌活性的PAW。同时，应该推进PAW 在食品工业中的应用研究，一方面是生产环境消毒中的应用，基于等离子体的氧化过程（POPs）可以进行废水净化和管路消毒，评价其对空气、水体、管路等的杀菌效果。另一方面是在农业中的应用，不少研究已经证明了PAW 在种子萌发、促进植物生长、微生物诱变育种等方面的效果。但PAW 的低pH 值和高ORP 环境还具有降解农药的潜力，是否有可能在果蔬上市前通过喷洒PAW 降低表面农残或者开发PAW 作为果蔬的清洗剂是一个值得深入探究的问题。最后应该加大PAW 引起肉类颜色变化、蛋白质和脂质氧化等的机理研究，考虑PAW 与其它非热技术或者是物理因素等的结合，以提高杀菌效果并最大程度地减少对肉类等产品感官和营养品质的负面影响。