特异性促炎症消退介质在牙周炎中作用的研究进展

白慧敏 张雨薇 孟姝 刘程程

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科 成都610041

牙周炎是由牙菌斑生物膜和宿主免疫炎症反应之间相互作用失衡，引发的牙周支持组织的慢性炎症性疾病。在健康状态下，炎症具有自限性，炎症会及时消退，减轻组织损伤并重建组织内稳态。牙周炎在一定程度上是牙周支持组织炎症消退的失败[1]。炎症消退是一个由特异性促炎症消退介 质（specialized pro-resolving mediator，SPM）调控的主动的程序化过程。炎性细胞凋亡在炎症消退过程中起着重要作用。SPM可减少中性粒细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）浸润，诱导中性粒细胞凋亡，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进细菌清除和组织再生，缓解疼痛。现有研究通过实验性牙周炎动物模型，已初步证实SPM在牙周炎症消退中的作用，SPM有望成为牙周炎防治的辅助方式。本文就SPM的分类、作用机制及其在牙周组织炎症和修复过程中作用的研究进展作一综述，以期对牙周炎症机制的研究和牙周炎防治新策略提供帮助。

1 炎症的发生和消退

炎症是机体应对微生物入侵或损伤的重要防御机制，以毛细血管扩张、通透性增强、血流量增加、白细胞募集和组织水肿为特征。微生物入侵机体后，病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）与细胞膜或细胞器膜表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）结合，激活靶细胞，促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6等多种细胞因子、趋化因子和促炎脂质介质的合成和分泌。这些促炎因子可诱导白细胞募集，进一步激活宿主的免疫反应。

在理想情况下，炎症反应具有自限性，其消退对受损组织的结构和功能恢复至关重要。炎症的消退并不是炎症反应的被动终止，而是一种组织水平上的“程序化消退方案”，是由SPM介导的主动且高度受控制的生化过程。1）在急性炎症消退阶段，基质细胞、实质细胞（如上皮细胞）及白细胞（单核细胞、巨噬细胞和Treg细胞等）相互作用生成SPM、抗炎细胞因子和模式识别受体抑制剂等；2）促炎因子被分解代谢；3）白细胞的进一步募集被抑制；4）炎性表型的单核/巨噬细胞受到清除；5）促炎消退表型的单核/巨噬细胞则发挥吞噬作用清除细胞碎片，特别是凋亡细胞；6）受损组织进一步恢复到炎症前的平衡状态，急性炎症才得以完全消退[2-4]。这种自限性的炎症反应是一种生理性保护机制，有利于受损组织的结构和功能恢复。而不受控制或未及时消退的炎症则会加剧组织损伤，引起慢性炎症性疾病或自身免疫性疾病，如牙周炎、心血管疾病、神经退行性疾病和代谢综合征等。

牙周组织的健康受龈下菌斑生物膜、宿主来源的促炎和促炎症消退因子以及多种局部和全身危险因素的影响[5]。牙周炎是由各因素之间作用失衡，引发的牙周支持组织的慢性炎症性疾病。关键致病菌定植，可以激发牙周组织多种防御机制。例如，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可激活多种细胞产生致炎细胞因子、基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）和活性氧（reactiveoxygen species，ROS）等炎性介质，引起组织内的氧化应激和炎症反应；中性粒细胞、单核/巨噬细胞迁移进入炎症部位，吞噬细菌并将其杀灭。在牙周炎症消退过程中，白细胞提供重要抗炎信号，生成SPM等促炎症消退因子，有效调节细菌生物膜及环境，包括抑制或消除病原体，维持局部稳态，参与干细胞增殖分化，激活成纤维细胞和成骨细胞，促进胶原合成，恢复上皮结构，诱导再生性骨愈合，从而促进牙周组织的再生和重建[6]。因此，SPM对牙周炎症消退具有重要作用。

2 特异性促炎症消退介质与牙周炎

SPM是由欧米茄3和欧米茄6多不饱和脂肪酸经环氧化酶（cyclooxygenase，COX）、脂氧合酶（lipoxygenase，LO）、细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）等一系列酶促反应代谢产生的脂类物质。目前已知的SPM主要包括消退素（resolvin，Rv）、脂氧素（lipoxin，LX）、巨噬细胞促炎症消退介质（macrophage mediators in resolving inflammation，MaR）以及组织再生中的共轭（conjugated in tissue regeneration，CTR）SPM等。SPM主要由中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞合成，血小板、上皮细胞等也可以产生SPM。研究[7-8]表明，SPM可与不同的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPR）包 括GPR18、GPR32和GPR37等结合，进而1）抑制中性粒细胞过度浸润及其介导的组织损伤；2）促进巨噬细胞M2样极化，加速伤口愈合；3）增强巨噬细胞的吞噬作用，逆转微生物失调；4）调节toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓 样 分 化 因 子88（myeloid differentiationfactor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、TNF-α/巨噬细胞炎症蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）/MMP-9等信号通路，缓解疼痛，促进组织再生。传统的抗炎药物如环氧合酶抑制剂，通过非特异性地阻断机体代谢途径来抑制炎症，而SPM属于受体激动剂，可特异性结合炎症中活跃的受体，主动发出炎症终止信号，促进消退炎症，且不会增加疾病的易感性[9]。

2.1 消退素

消退素是欧米茄3多不饱和脂肪酸的代谢产物，根据来源可分为D系列（resolvin D，RvD）、E系列（resolvin E，RvE）和T系列（resolvin T，RvT）。D系列以二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）为前体，经COX-2催化合成RvD1～6；E系列以二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）为前体，经COX-2催化产生18R-HEPE和18S-HETE，并进一步由5-LO代谢生成RvE1～3，EPA经15-LOX和5-LOX依次催化合成RvE4[10]；与E系列相似，T系列也经COX-2和5-LO催化产生RvT1～4，但以二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，n-3DPA）为底物，也称为RvDn-3DPA[11]。消退素的下游受体主要包括：GPR18、GPR32、甲酰基肽受体2（formly peptide receptor 2，FPR2）/脂氧素A4受体（lipoxin A4 receptor，ALXR）、趋化因子配体（chemerin receptor 23，ChemR23）受体和白三烯B4受体（leukotriene B4receptor，BLT1）[12]。不同的消退素通过特异性地激活相应的受体调控下游信号通路，促进炎症消退，具体见表1。

表1 消退素及相应受体Tab 1 Resolvins and their corresponding receptors

研究[20]表明，3个系列的消退素均有利于牙周组织炎症消退和组织修复。RvD可降低NF-κB受体活化因子配体/骨保护素（receptor activator nuclear factor-κB ligand/osteoprotegerin，RANKL/OPG）比值，以预防实验性牙周炎小鼠的牙槽骨丧失，并可剂量依赖性地增加牙周膜细胞（periodontal ligament cells,PDLCs）的迁移和增殖能力[21]。RvD还可增强巨噬细胞介导的细菌清除作用[22]，并增强调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的产生和功能[23-24]。RvD1与其中间体17-HDHA还可增加B细胞免疫球蛋白IgG和IgM的生成来影响适应性免疫[25]。此外，Maekawa等[26]发现RvD1可逆转IL-17对内皮细胞发育调节基因座-1（developmental endothelial locus 1，Del-1）的抑制作用，从而限制PMN向牙龈组织的募集。

RvE在牙周炎症消退中的作用也已经得到了初步证实。体外研究[27]发现，RvE1可通过调控PDLCs，影响炎症微环境中IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平，减轻疼痛，并可抑制痛觉过敏[28]。RvE1还具有修复牙周炎患者巨噬细胞吞噬作用的潜能。1 nM RvE1即可修复局限性侵袭性牙周炎（localized aggressive periodontitis，LAP）患者巨噬细胞受损的吞噬功能至健康水平[29]。在动物模型中，RvE1可促进牙周局部炎症消退，缓解牙槽骨吸收，并促进骨再生[30]。Lee等[31]通过大鼠牙周炎模型也证实，局部应用RvE1可逆转炎症反应基因，如趋化因子C-C基序配体3（chemokine C-C motif ligand 3，CCL3）、趋化因子C-X-C基序配体1（chemokine C-X-Cmotif ligand1，CXCL1）、CXCL2、IL1B、IL18BP、MMP-3、MMP-10、MMP-13等的表达，促进炎症消退。此外，RvE1还可抑制PMN中ROS的合成[32-33]。以上研究均提示，RvE1在牙周炎的防治中具有很大的应用潜能。但RvE1促进牙周组织再生的机制，及其与其他牙周组织再生材料的协同作用尚不明确，亟待进一步研究。

与RvD和RvE相似的是，RvT也可明显减少PMN浸润，并降低IL-6的表达，还可以增强巨噬细胞介导的细菌清除作用[34]。但是，RvT在牙周组织炎症中的作用尚不明确。

2.2 脂氧素（lipoxin，LX）

LX由花生四烯酸（arachidonic acid，AA）衍生而来，具有典型的三羟基四共轭双键结构，主要包括LXA4、LXB4及阿司匹林诱导性脂氧素（aspirin-triggered lipoxins，ATL）。LX具有3个主要合成途径：1）在黏膜组织（如胃肠道、气道和口腔中），AA通过15-LO、5-LO催化生成LXA4和LXB4；2）在血管中，AA可分别经5-LO和12-LO催化生成LXA4和LXB4；3）阿司匹林不可逆地乙酰化COX-2，AA经乙酰化的COX-2催化生成中间体15R-HETE，再由5-LO迅速转化为15-epi-LXA4和15-epi-LXB4，其15C的羟基为R构象，称为ATL[35]。ATL也可促进炎症消退，且相比天然LX具有更高的稳定性和生物活性[36]。除了促进ATL的合成，阿司匹林还可通过乙酰化COX-2阻断前列腺素的合成，从而发挥消炎作用。

研究[37-38]表明，LX可与FPR2/ALXR结合，充当内源性“炎症终止信号”，从而抑制PMN与内皮细胞或上皮细胞间的黏附、抑制其跨膜运动及趋化，并明显增强牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的增殖和迁移能力。Serhan等[39]发现，在过表达15-LO的转基因兔外周血PMN中LX的生成增加，且在丝线结扎结合局部接种P.gingivalis诱导牙周炎后，转基因兔相比非转基因兔，牙槽骨丢失和局部炎症明显减少；在非转基因兔的牙周炎模型中局部应用ATLa，6周后发现实验组相比对照组牙槽骨丢失和炎症浸润都有明显降低。在小鼠背部气囊模型中局部注射LX或ATLa可通过减少PMN浸润及炎性因子前列腺素E2的产生进而调控炎症过程[40]。Ali等[7]在体外模型中发现，LXA4可通过调控大肠杆菌LPS攻击的PDLCs中促炎和抗炎细胞因子的表达抑制炎症过程，这一过程与细胞内TLR4/MyD88/NF-kB信号通路被抑制有关。LXA4还可逆转炎症状态下PDLCs对破骨细胞的诱导增强作用，对牙槽骨吸收具有一定的保护作用[41]。

LX也可作用于巨噬细胞，增强其吞噬能力。Mitchell等[42]在大鼠腹膜炎模型的腹膜内注射LXA4或15-epi-LXB4和15(R/S)-甲基-LXA4后推注示踪探针标记的凋亡人PMN，发现单核/巨噬细胞对PMN的吞噬作用明显增强，提示LX和LX稳定类似物在体内可促进单核/巨噬细胞对凋亡PMN的吞噬作用。LXA4也可抑制P.gingivalis的LPS诱导的巨噬细胞炎症中炎症小体和炎性标志物的激活[43]。因此，LX具有促进PDLSCs增殖、迁移及增强单核/巨噬细胞吞噬的作用，有利于牙周炎症的消退和组织修复。

2.3 保护素

DHA在PMN、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞中代谢生成17-HDHA，并进一步由15-LO催化生成保护素D1（protectin D1，PD1），在神经系统中产生时称为神经保护素D1（neuroprotectin D1，NPD1）。17-HDHA经阿司匹林乙酰化的COX-2催化生成PD1的顺反异构体AT-PD1，PD1还可异构化生成其同分异构体保护素DX（protectin DX，PDX）[44-45]。此外，n-3DPA也可作为底物经酶促反应生成PD1n-3和PD2n-3[8]。

研究[46]证实，PD1和PDX均可抑制炎症过程中的PMN浸润。体外研究发现，10 nmol·L-1的PD1减弱了PMN迁移约50%。而在小鼠腹膜炎模型中，PD1可减少炎症开始后的PMN浸润＞90%，且该作用可与RvE1叠加。PDX可通过抑制TNF-α/MIP-2-MMP9信号通路限制中性粒细胞浸润[8]。PD1和PDX还可作用于巨噬细胞增强其吞噬作用，抑制促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，从而缓解炎性疼痛，促进炎症消退[8]。而保护素与牙周炎的关系，尤其是AT-PD1和n-3系列保护素的作用仍有待进一步探究。

2.4 MaR

MaR最初在人巨噬细胞中发现，包括以DHA为底物合成的MaR1和MaR2，以及n-3DPA为底物的MaR1n-3、MaR2n-3和MaR3n-3。DHA由12-LO催化产生13s，14s环氧化物中间体，并进一步在15-LO催化下生成MaR1，在可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）作用下生成MaR2[47-49]。

MaR1可激活富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体（leucine rich repeat containing G proteincoupled receptor 6，LGR6），继而引发第二信号cAMP和阻抗变化，抑制细胞内黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）上调和CXCL1途径，从而抑制PMN沿IL-8浓度梯度的迁移，减弱ROS生成[50-51]。在小鼠腹膜炎模型中，MaR2也表现出与MaR1相当的限制PMN浸润作用[52]。

MaR1和MaR2可增强巨噬细胞的吞噬作用，促进巨噬细胞M2型极化，且MaR1相较MaR2更有效[52]。MaR1孵育可明显增加巨噬细胞甘露糖受体C1的表达，进而促进巨噬细胞M2型极化。动物实验也表明，在大鼠拔牙窝中局部应用MaR1可有效加速拔牙窝愈合，减少牙槽骨吸收，增加M2样巨噬细胞表面标志物CD206的相对表达[53]。此外，MaR1前体对巨噬细胞M2型极化也具有促进作用，而M2型相比M1型巨噬细胞可生成更多MaR1[34]，这种正反馈调节机制也值得进一步探究。

在炎症因子IL-1β和TNF-α刺激的hPDLSC模型中，MaR1和RvE1可防止炎症引起的细胞多能性降低，恢复牙周膜样细胞表型标志物的表达，以及细胞增殖和迁移能力，提高成骨活性[54]。MaR1还可增加Treg细胞水平，降低Th17细胞水平从而调节Treg/Th17平衡，影响适应性免疫[23]；降低急性结肠炎中LPS刺激引起的炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、干扰素（interferon，INF）-γ的分泌[23]；抑制TLR4/MAPK/NF-κB途径来发挥抗炎作用，并激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）抗 氧 化途径[55]。

综上，MaR1和MaR2均具有抑制PMN浸润和增强巨噬细胞吞噬的作用。MaR1也被证实可促进巨噬细胞向M2型极化，并参与调节适应性免疫及抑制炎性因子的产生；同时，过量ROS与宿主抗氧化状态的降低在牙周炎的发病机制和进展中起核心作用，MaR1可通过减弱ROS生成、激活Nrf2途径介导抗氧化作用，在牙周炎炎症消退过程中具有一定潜力。目前对于MaR2和MaRn-3的研究有限，仍需要进一步研究探索其生物学作用及相关机制。

2.5 组织再生中的共轭SPM

组织再生中的共轭SPM以DHA为底物合成，包括MaRs CTR（MCTR）1～3、Rvs CTR（RCTR）1～3和保护素CTR（protectin CTR，PCTR）1～3[56-57]。

MCTR可剂量依赖性地增加人巨噬细胞对凋亡PMN和大肠杆菌的吞噬作用，并可促进涡虫模型中的组织再生[56]。Dalli等[58]对小鼠进行迷走神经切断术以延迟大肠杆菌感染性炎症的消退；而给予PCTR1可显著降低中性粒细胞募集，逆转巨噬细胞标志物的改变，上调巨噬细胞的吞噬作用，并将消退间隔从36 h缩短至22 h，提示PCTR可恢复巨噬细胞功能，促进小鼠内细菌感染性炎症的消退。作为一类新发现的SPM，CTR对应受体及其生物学机制亟待研究。

2.6 SPM前体

脂溶性脂肪酸作为SPM生成的底物，渗透能力强，可被黏膜迅速吸收达到较高浓度。Rosenstein等[59]发现，在通过不刷牙进行人牙龈炎诱导的过程中，局部应用含欧米茄6脂肪酸的漱口水可明显改善牙龈炎症和牙周袋探诊深度。除了局部应用，膳食补充脂肪酸也可缓解实验性牙周炎大鼠的牙槽骨吸收[60]。在慢性牙周炎患者中使用欧米茄3多不饱和脂肪酸+阿司匹林作为牙周洁刮治的辅助手段，唾液中RANKL、MMP-8水平显著降低，牙周袋探诊深度、附着丧失水平显著降低，PD＜4 mm位点数明显增加[61]。Castro Dos Santos等[62]发现，在中重度牙周炎伴Ⅱ型糖尿病患者中，使用机械疗法去除龈下菌斑生物膜后，使用欧米茄3不饱和脂肪酸+阿司匹林作为宿主调节疗法，平均附着丧失水平、探诊后出血、糖化血红蛋白数值相较于仅接受牙周清创术组均有降低，提示这个疗法可能有助于控制牙周炎症和血糖水平。

3 SPM应用于牙周病治疗的问题及应对策略

控制炎症和促进再生是牙周病治疗的终极目标。现有的研究表明，SPM不仅可促进牙周炎症消退，还有利于组织修复和再生，在牙周病治疗中具有极大的应用潜能。然而，SPM的稳定性仍有待提高。一方面，部分SPM在体内易被迅速转化失活。另一方面，目前大多数试验将SPM溶解于乙醇，并悬浮在磷酸缓冲盐溶液中应用，此种处理方式并不能使SPM达到最佳稳定性。针对SPM体内易失活的特点，可将SPM设计成能够维持其结构完整性的稳定类似物。例如，15(R/S)-甲基-LXA4是LXA4和15-epi-LXA4的外消旋稳定类似物，可避免被15-羟基前列腺素脱氢酶脱氢；还可将苯基与C-16键结合，取代分子的ω-端，以防止脱氢和ω-端氧化；或通过将氟化物添加到苯氧基环的对位以阻止其降解，生成15-epi-16-苯氧基-对氟-LXA4稳定类似物ATLa。这些修饰也可改善局部递送作用，有助于其迅速向组织中分布[63]。合适的药物载体也可以改变药物在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到牙周局部组织。膜脱落的囊泡（微粒）已被证明具有抗炎特性，并可用于有效输送SPM。有学者[64]在猪实验性牙周炎模型中，使用微粒构建了包含脂氧素类似物bLXA4的纳米药物，并将其局部应用作为牙周洁刮治的辅助疗法。结果表明，与单纯bLXA4处理相比，bLXA4纳米颗粒处理对炎性细胞浸润的抑制作用和牙周组织再生的促进作用更显著。此外，水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，也是良好的药物缓释载体。有学者[65]将LXA4制备成热可逆异氰基肽水凝胶，局部应用于患有牙周炎的犬牙周组织，发现水凝胶药物体外释放时间约4 d，并可显著降低龈下微生物负荷和IL-8水平。与LXA4溶液相比，水凝胶的局部使用也更加便利。

作为SPM，消退素、脂氧素、保护素和MaR等均具有促进炎症消退的作用，但保护素在牙周炎中的作用尚不清楚。体外实验发现，SPM可介导巨噬细胞表型改变，增强吞噬能力，调节适应性免疫细胞，抑制破骨细胞分化，增强成骨细胞功能，减少破骨细胞前体和成骨细胞之间的相互作用进而抑制炎症诱导的骨吸收[66]。动物研究表明，SPM可抑制白细胞浸润和破骨细胞活性，预防牙槽骨吸收，促进骨再生[67]。这提示，以SPM及其稳定类似物、多不饱和脂肪酸为基础合成具有促炎症消退作用的药物来控制牙周炎症，具有广阔的开发应用前景。但SPM促进组织再生的机制，其在牙周炎症和修复过程中的生物合成和代谢组学，需要进一步明确。设计能在体内维持稳定性且具有良好生物活性的稳定类似物，靶器官摄取不饱和脂肪酸进而转化为SPM的剂量关系也有待研究，以确定最佳给药时机和剂量。不同SPM促进牙周组织炎症消退的效果、给药的时机和剂量、合适的药物载体和生物安全性也需要临床试验进行比较研究。

4 总结与展望

SPM在炎症的消退过程中起重要作用，可通过限制中性粒细胞浸润、促进巨噬细胞M2型极化、增强巨噬细胞的吞噬功能、逆转微生物失调等作用促进炎症消退和组织再生。在动物牙周炎模型中，局部应用RvE1、ATLa或膳食补充欧米茄3脂肪酸可抑制白细胞浸润，预防牙槽骨吸收，促进骨再生。RvE1和欧米茄3脂肪酸促进牙周炎症消退的作用也得到了临床试验的初步证实。可见，SPM有望应用于牙周炎的治疗中，抑制炎性牙槽骨吸收，促进炎症消退和组织修复。然而，关于SPM的研究仍存在诸多问题，亟待进一步的基础研究与临床试验，明确不同SPM在牙周组织的相对积聚量、SPM与不同牙周细胞的作用受体及相关信号通路、牙周组织对SPM摄入的有效剂量及SPM的代谢动力学特点等。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。