清热解毒方抗低危型人乳头瘤病毒作用的体外实验研究

冉雪梦，吕佳，孙选

[青岛市中医医院（市海慈医院），山东 青岛 266033]

低危型人乳头瘤病毒（HPV）主要引起尖锐湿疣（CA）、皮肤疣等疾病，其中CA又称生殖器疣或性病疣，是由HPV感染引起的表皮良性增生性疾病，90%CA与HPV-6型与HPV-11型感染有关[1]，张钰颖等[2]通过对CA患者组织中的HPV型别进行研究发现，感染率较高的依次为HPV-6/11、HPV-6、

HPV-11，在欧美及非洲地区HPV-6占70%以上，其次是HPV-11型。目前对于CA的治疗多是去除疣体，尚缺乏预防疾病复发的有力措施。本研究所用的清热解毒方，通过水煎外洗治疗外阴CA、皮肤病毒性疣，已用于临床10余年，疗效显著。本实验拟对清热解毒方在抗低危型HPV（HPV-6，HPV-11）方面的体外活性、作用方式以及作用机制等进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药 清热解毒方组成：金银花30 g、大青叶 30 g、板蓝根 30 g、紫草 30 g、虎杖 30 g、薏苡仁30 g、土茯苓 30 g、白花蛇舌草 30 g、木贼 30 g、连翘15 g、当归 15 g、赤芍 15 g、莪术 15 g、黄柏 15 g、苦参15 g和生甘草10 g，由青岛市海慈医疗集团制剂室制备，采用密闭单体煎药机（SJ20）煎煮2次，过滤浓缩至1 000 g/L，冷却后放入4℃冰箱储存备用。

1.1.2 试剂 HPV-6和HPV-11假病毒（中国海洋大学制备，批号：20190103）；Hela细胞（中科院上海细胞库，批号：ATCCCCL-2.1）；293 FT 细胞（中科院上海细胞库，批号：ATCC ACS-4500）；磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）（碧云天生物技术有限公司，批号：AF5905）、磷酸化的蛋白激酶（p-Akt）（碧云天生物技术有限公司，批号：AF6180）、β-actin（碧云天生物技术有限公司，批号：AA128），DMEM高糖培养基（Life technoligies corporation，批号：12100-038），胰酶（索莱宝，批号：T8151）；0.05%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（美国Invitrogen，批号：25300-054）；Pierce Firefly Luciferase Glow Assay Kit（Thermo scientific，批号：16177）；磷酸盐缓冲液（PBS）、洗膜缓冲液（TBST）、杜氏磷酸缓冲液（DPBS）均为实验室配制。

1.1.3 仪器 CO2恒温箱（美国，Thermo Scientific，Herocell 150）；酶标分析仪（奥地利，Rainbow，MLS-3750）；高温灭菌锅（日本，SANYO电机株式会社，MLS-3750）；荧光正置显微镜（日本，OLYMPUS，BX51）；低温离心机（美国，Beckman，GS-15R）。

1.2 实验方法

1.2.1 清热解毒方对细胞的毒性测定 将50 μL含有12 000 cells/mL 293FT细胞及Hela细胞液分别铺到96孔板中，培养过夜。次日，将培养液吸出，每孔加入新鲜DMEM培养基90 μL；用DMEM培养基将中药稀释成100～6.25 g/L（1/10～1/160稀释倍数）药液，每孔加入10 μL中药稀释液，每个浓度重复3孔。并设置空白对照组（中药以PBS1×代替）。24 h后每孔添加 100 μL改良 Eagle培养基（DMEM），继续培养至 48 h，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐染料法（MTT）[3-4]检测细胞生长情况，以相对存活率情况（中药组/空白对照组×100%）评价清热解毒方的细胞毒作用。

1.2.2 清热解毒方抗HPV感染的药效学评价 将50 μL含有12 000 cells/mL 293FT细胞的细胞液铺到96孔板中，培养过夜。次日，将培养液吸出，每孔加入新鲜DMEM培养基40 μL；同时，用DMEM培养基稀释假病毒液，每孔加入50 μL HPV-6及HPV-11假病毒稀释液（2.16 TU/mL）；用DMEM培养基将中药稀释成100～6.25 g/L（1/10～1/160稀释倍数）药液，每孔加入10 μL中药稀释液，每个浓度重复3孔。并设置空白对照组（病毒以DMEM培养基代替，中药以PBS 1×代替）和病毒对照组（中药以PBS 1×代替）。24 h后每孔添加100 μL DMEM培养基，继续培养至48 h，检测荧光素酶的表达情况，以相对荧光表达情况（中药组/病毒对照组×100%）评价清热解毒方的抗HPV效果。

1.2.3 清热解毒方作用方式的探讨 按照1.2.2中的实验步骤，配置25 g/L中药液以及2.16 TU/mL HPV-6假病毒稀释液，探讨清热解毒方抗病毒的4种作用方式，每种作用方式重复3孔，分别为①药物预处理病毒：将10 μL中药液加入到50 μL稀释病毒液中孵育30 min，然后加入细胞中，再加入新鲜的DMEM培养基40 μL；②药物预处理细胞：将10 μL中药液加入到细胞中孵育30 min，然后加入50 μL稀释病毒液，再加入新鲜的DMEM培养基40 μL；③病毒吸附同时加入药物：将50 μL稀释病毒液、40 μL新鲜的DMEM培养基以及10 μL中药液同时加入到细胞中，再加入新鲜的DMEM培养基40 μL；④病毒处理后加入药物：加入 50 μL稀释病毒液以及40 μL新鲜的DMEM培养基，再加入中药液10 μL。并设置空白对照组和病毒对照组。37℃、CO2恒温箱培养；24 h后每孔添加100 mL DMEM培养基，继续培养至48 h，检测荧光素酶的表达情况，以相对荧光表达情况（中药组/病毒对照组×100%）评价清热解毒方的抗HPV作用方式。

1.2.4 清热解毒方作用机制的探讨 将100 μL含有5 000 cells/mL Hela细胞的细胞液铺到6孔板中，培养过夜。次日，将培养液吸出，将清热解毒方母液用DMEM培养基稀释成不同的浓度（100、50、25、12.5 g/L），并设立病毒对照组（以 PBS 1×代替）。培养至48 h后，分别提取各个孔中的总蛋白，测定p-PI3K及p-Akt的表达情况。分别将提取的蛋白与一抗（p-PI3K 一抗稀释比例为1∶1 000；p-Akt一抗稀释比例为 1∶1 000；β-actin 一抗稀释比例为 1∶1 500）及二抗孵育，最后采用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，以p-PI3K及p-Akt为目的蛋白，βactin为内参，应用凝胶定量分析软件Gel-Pro 32 analyzer对蛋白显色结果进行图像分析，并计算得到各组的灰度值，以β-actin内参的灰度值作为对照，计算各个给药浓度的PI3K及Akt蛋白的相对灰度值，并以对照孔比较计算抑制率。

1.2.5 检测指标 委托中国海洋大学医药学院对荧光素酶的荧光值指标进行检测，按照说明书具体操作方法为：吸取细胞培养液后，加入适量的细胞裂解液，充分裂解后，10 000 r/min，离心半径为5 cm，离心3 min，去上清用于测定。溶解荧光素酶检测试剂，并达到室温，取样品20 μL于96孔板中，并加入50 μL/孔细胞裂解液，酶标仪检测612 nm的荧光素酶数值，以报告基因细胞裂解液为空白对照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，所有数据以±s表示，采用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清热解毒方对细胞的毒性测定 采用293FT细胞及Hela细胞评价清热解毒方对细胞存活率的影响，结果显示清热解毒方对细胞安全无毒，可应用于进一步的实验研究。见表1。

表1 清热解毒方对细胞的毒性作用 （±s）

表1 清热解毒方对细胞的毒性作用 （±s）

H e l a相对存活率（%）空白对照组 0 1 0 0 1 0 0 1/1 0 稀释组 1 0 0 9 3.2±0.8 9 5.3±1.2 1/2 0 稀释组 5 0 9 4.6±1.0 9 6.4±2.6 1/4 0 稀释组 2 5 9 4.1±0.4 9 8.5±1.0 1/8 0 稀释组 1 2.5 9 8.6±1.5 9 7.1±3.1 1/1 6 0 稀释组 6.2 5 9 7.3±0.5 9 8.7±1.3组别 用药剂量（g/L）2 9 3 F T相对存活率（%）

2.2 清热解毒方抗HPV活性评价 采用HPV体外假病毒模型，研究清热解毒方抗低危型HPV感染的作用，结果显示病毒对照组与空白对照组相比，HPV病毒荧光表达差异有统计学意义（P＜0.01），说明HPV感染模型表达成功。与病毒对照组相比，中药在6.25～100.00 g/L的给药剂量下，各个HPV组别均能显著降低感染细胞内HPV病毒荧光素酶的表达，且呈现明显的剂量依赖关系。其中中药浓度为25～100 g/L时，中药能显著抑制HPV-6的荧光表达（P＜0.01）；中药浓度为 50～100 g/L 时，中药能显著抑制HPV-11的荧光表达（P＜0.01）。以上实验结果表明清热解毒方有抗低危型HPV感染的作用。见表2。

表2 清热解毒方抗HPV感染作用 （±s）

表2 清热解毒方抗HPV感染作用 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与病毒对照组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

H P V-1 1相对荧光值（%）空白对照组 0 0 0病毒对照组 0 1 0 0.0±1.2* 1 0 0.0±1.2*1/1 0 稀释组 1 0 0 1 3.5±0.8** 1 9.4±1.2**1/2 0 稀释组 5 0 2 1.6±1.0** 3 5.2±2.6**1/4 0 稀释组 2 5 3 5.0±0.4** 4 1.0±1.0#1/8 0 稀释组 1 2.5 5 8.0±1.5# 5 0.7±3.1#1/1 6 0稀释组 6.2 5 6 4.5±0.5# 6 1.8±1.3#组别 用药剂量（g/L）H P V-6相对荧光值（%）

2.3 清热解毒方抗HPV作用方式研究 采用HPV体外假病毒模型，研究清热解毒方抗HPV-6的作用方式，用25 g/L中药稀释液预处理病毒（Pre-virus）、中药液在病毒感染之前预处理细胞（Pre-cell）、病毒吸附同时加入药液以及病毒吸附之后加入药液。结果发现病毒对照组与空白对照组相比，荧光表达量升高，且差异有统计学意义（P＜0.01），说明模型表达成功。与病毒对照组相比，在4种不同的作用方式下，清热解毒方都能显著降低HPV病毒的表达（P＜0.05），其中药物预处理病毒及病毒吸附时加药的效果更加显著（P＜0.01），说明清热解毒方可用于HPV感染的防治。见表3。

表3 清热解毒方抗HPV作用方式 （±s）

表3 清热解毒方抗HPV作用方式 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与病毒对照组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

组别 用药剂量（g/L） 相对荧光值（%）空白对照组 0 0病毒对照组 0 100.0±4.1*药物预处理病毒组 25 26.3±1.3**药物预处理细胞组 25 61.0±1.2#病毒吸附时加药组 25 29.6±1.0**病毒吸附后加药组 25 72.4±1.4#

2.4 清热解毒方抗低危型HPV作用机制研究 PI3K、Akt是HPV病毒感染过程中的重要蛋白，本实验探讨清热解毒方对Hela细胞中p-PI3K及p-Akt的影响，结果显示与病毒组比较，清热解毒方浓度为12.5～100.0 g/L时，能够抑制PI3K及Akt蛋白的表达。与病毒组比较，清热解毒方浓度为50～100 g/L之间均能显著抑制PI3K的磷酸化（P＜0.05），其中100 g/L浓度时差异有统计学意义（P＜0.01）；与病毒组比较，清热解毒方浓度在25～100 g/L范围内，细胞中的Akt蛋白表达含量下降（P＜0.05），其中在50～100g/L 范围内，Akt蛋白表达显著性下降（P＜0.01）。以上实验说明清热解毒方是通过抑制PI3K-Akt磷酸化促进细胞的凋亡。见图1、2。

图1 清热解毒方对Hela细胞中PI3K、Akt表达的影响

图2 清热解毒方对Hela细胞中PI3K、Akt表达的影响

3 讨论

本研究中的清热解毒方为经验方，临床应用10余年，水煎外洗局部治疗CA，疗效显著。方中金银花为“疮疡圣药”，最善清热解毒疗疮；大青叶、板蓝根清热解毒、凉血消肿，紫草、虎杖凉血活血并利湿，薏苡仁、土茯苓、白花蛇舌草利湿消肿；连翘、木贼疏风清热，连翘亦解毒消肿散结，当归、赤芍、莪术活血化瘀、消肿散结，黄柏、苦参清热燥湿；生甘草清热解毒、调和诸药。全方共奏清热解毒，活血祛湿，消肿散结之功效。现代药理研究亦表明[5]，金银花、连翘、大青叶、板蓝根、紫草、虎杖、土茯苓、白花蛇舌草等有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等作用。前期临床研究发现，清热解毒方可抑制高危型HPV病毒的表达，局部用药对于宫颈HPV转阴的临床疗效确切，明显优于辛复宁[6]，临床使用安全可靠；另外通过实验研究发现，清热解毒方能抑制Hela细胞中E6、E7致癌蛋白及肿瘤相关因子ERK、NF-κB的表达[7]。E6和E7是HPV致癌蛋白，分别与细胞内抑癌蛋白P53、磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白（PRb）结合，诱导细胞癌变[8]；细胞外信号调节激酶（ERK）以及细胞核因子（NF）-κB 在肿瘤中高度表达，能抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的发生发展[9-10]。以上研究均为清热解毒方抗HPV作用研究提供了理论基础。前期通过临床观察发现清热解毒方水煎浓缩药液局部外洗治疗复发性CA疗效显著，对于低危型HPV转阴效果确切，安全性高，为清热解毒方防治CA的新药开发提供了临床依据。本研究对药物体外抗低危型HPV作用进行探讨，但HPV传染性强，致病率高，并对组织分化有严格要求[11]，在体外难以进行组织培养，给科研工作带来极大的困难，而近年来研究发现，采用病毒衣壳蛋白制备而成的假病毒安全性较高[12]，假病毒有天然病毒的类似大小及结构，且有非宿主细胞依赖、非周期依赖、安全性高、体外易于培养等优点，作为一种安全的研究手段，其在HPV病毒研究中发挥着重要的作用[13-15]。

本研究采用HPV荧光素酶体外假病毒模型，评价清热解毒方抗低危型HPV活性，并探讨其抗HPV作用方式（药物预处理病毒、药物预处理细胞、病毒吸附时加药、病毒吸附后给药），为清热解毒方在CA等疾病的治疗中提供理论基础。实验结果表明，清热解毒方在细胞水平安全无毒，并可以显著抑制HPV假病毒的感染，且呈现明显的剂量依赖关系；进一步实验结果表明，清热解毒方可通过多种方式来抑制HPV感染，其中药物预处理病毒及病毒吸附同时加药的效果显著（P＜0.01），说明清热解毒方能够防治HPV感染，并抑制病毒进入细胞过程。PI3K家族参与多种信号通路，调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等[16]。PI3K活化而产生的类脂产物3，4-二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇作为第二信使激活多种细胞内的AktB和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（PDK）1，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308导致Akt的活化。PI3K及处于其下游的Akt的信号通路在人类肿瘤的发生发展演变过程中发挥重要作用，该信号通路调节肿瘤细胞的增殖和存活，调节细胞恶性转化等，并通过多方面机制，使宿主细胞发生转变，甚至是癌变[17]。本研究发现清热解毒方可显著抑制PI3K及Akt的磷酸化抑制其表达，为HPV导致的CA等疾病的治疗提供新的途径和创新性的理论依据。