BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多态性与脑卒中后焦虑的关系

沙娟娟，翟洁敏，郑莉莉，何剑波

急性脑卒中病人的日常生活能力常受到严重影响，约30%的脑卒中病人常伴随明显的精神症状，研究发现，24%的脑卒中病人出现脑卒中后焦虑(post-stroke anxiety，PSA)，且焦虑症状可持续2～5年，导致病情恢复缓慢，致残率增加，严重影响病人的生活质量[1-3]。因此，有效地诊断和管理PSA显得尤为重要。以往的研究主要集中在社会人口学和发病前脑卒中相关因素的分析，有关PSA的生物学机制尚不明确[1，4]。研究表明，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)参与了脑卒中后神经元的可塑和神经的发生，并抑制细胞凋亡，可能是发生PSA潜在的生物学机制，且BDNF表达的减少与压力的易感性增强有关，使焦虑的患病率明显增加[1，5]。研究表明，海马区神经元BDNF的广泛表达及其在突触的长时程记忆中的作用与焦虑的生物学机制密切相关[1]。同时，BDNF的表达受表观遗传基因的调控，在核苷酸196 G/A处具有功能性单核苷酸多态性(SNP)，即66位点处缬氨酸被蛋氨酸替代(Val66Met)，与普通人群相比，SNP在脑卒中病人中更易出现焦虑症状[6-7]。此外，BDNF基因中DNA甲基化还受环境应激因素的影响，通过增加CpG甲基化水平，减少BDNF基因的表达[1]。脑卒中后抑郁(PSD)与BDNF相关性研究较多，但有关BDNF甲基化水平及Val66Met基因多态性与急性期和慢性期PSA易感性的相关性动态前瞻性研究较少。本研究拟探讨脑卒中2周和1年后BDNF甲基化水平和BDNF Val66Met 基因多态性与PSA易感性的关系及其相互作用，为早期识别高风险的PSA病人提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2018年9月在西电集团医院神经内科住院的急性脑卒中病人268例，随访观察1年，拒绝随访和失访病人60例，纳入208例病人，2周后和1年后根据医院焦虑抑郁量表(HADS)将其分为脑卒中2周后病人队列(PSA病人25例，非PSA病人243例)和脑卒中1年后病人队列(PSA病人33例，非PSA病人175例)，诊断标准依据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[8]。所有入选病人均接受抗血小板聚集、降脂、稳定斑块、护脑、改善循环、营养神经、减轻水肿等基础治疗。收集所有病人脑卒中后2周和1年后的基线资料，包括年龄、性别、受教育年限、既往史(抑郁史、脑卒中史、高血压、糖尿病、心脏病、高胆固醇血症)、体质指数(BMI)、脑卒中部位。本研究获得西电集团医院伦理委员会批准，入选者均自愿签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①脑磁共振成像(MRI)诊断为缺血性脑卒中者；②能够独立完成全部调查和问卷者。排除标准：①严重威胁生命或影响脑卒中康复的疾病，如大面积脑梗死或脑出血等；②言语困难、构音障碍等交流障碍者；③其他神经、精神合并症包括痴呆、帕金森病、脑瘤、癫痫、精神病和/或酒精和物质依赖性精神病者；④简易精神状态评价量表(MMSE)<16分者。

1.3 焦虑抑郁及神经功能评分测定 采用医院焦虑抑郁量表(Hospital Anxiety and Depression Scale，HADS)对脑卒中后2周及1年后病人的焦虑症状进行测评。由两名经验丰富的主治及以上医生进行评分，取算术平均值为最终得分，此量表是包括针对焦虑(HADS-A)和抑郁(HACS-D)症状的2个亚量表，各7个问题，本研究主要进行HADS-A评分，11～21分为确定存在焦虑症状，7～10分为可疑焦虑，<7分为无焦虑症状，即≥7分可确诊为PSA病人[1，9]。神经功能缺损程度采用美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)评定，分值为 0～45分，神经功能缺损程度越严重分值越高。抑郁状态应用汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale，HAMD)进行评估，≥8分可诊断为PSD。

1.4 BDNF基因甲基化、Val66Met基因多态性分析 采集静脉血，提取DNA，使用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)检测BDNF基因启动子区甲基化水平，严格按照甲基化试剂盒操作(QIAGEN公司生产)，包括7个CpG位点、BDNF基因启动子CpG岛序列。参考UCSC网站(http://genome.ucsc.edu/)，设计相应甲基化引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段，跑胶进行胶回收PCR产物测序，分析CpG位点甲基化水平，基于限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR)对BDNF基因上的SNP Val66Met进行基因分型(val/val、val/met及met/met)。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 脑卒中后2周和1年均诊断为PSA病人6例，脑卒中后1年PSA患病率(15.9%)较脑卒中后2周PSA患病率(9.3%)明显升高(χ2=4.677，P=0.031)。脑卒中后2周时，与非PSA病人比较，PSA病人年龄较小，女性、抑郁史、PSD、前循环脑卒中部位占比明显增加，后循环脑卒中部位占比明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。脑卒中后1年，与非PSA病人比较，PSA病人女性占比、NIHSS评分、PSD占比、高血压史占比明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组BDNF基因甲基化水平和Val66Met多态性基因型比较 脑卒中后2周，与非PSA病人比较，PSA病人Val66Met基因多态性met/met基因型占比明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；脑卒中后1年，与非PSA病人比较，PSA病人CpG2、CpG9位点及平均CpG 甲基化水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组BDNF基因甲基化水平和Val66Met多态性基因型比较

2.3 BDNF基因甲基化水平、Val66Met基因多态性对PSA的影响 将年龄、性别、抑郁史、NIHSS评分、PSD、前循环脑卒中、后循环脑卒中、高血压史、各CpG位点、CpG平均甲基化水平及Val66Met基因多态性等变量纳入单因素Logistic回归分析，各因素经协变量调整后，PSD、后循环脑卒中是脑卒中后2周PSA发生的影响因素(P<0.05)，性别(女性)、PSD、高血压是脑卒中后1年PSA发生的影响因素(P<0.05)。详见表3。

表3 脑卒中后2周和1年PSA影响因素的Logistic回归分析

2.4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多态性对PSA易感性的多因素Logistic回归分析 脑卒中后2周，PSA病人易感性与Val66Met基因多态性中met/met基因型有关(P<0.05)；脑卒中后1年，PSA易感性与BDNF启动子区域CpG2、CpG9位点及平均CpG甲基化水平有关(P<0.05)；在相乘作用模型中，脑卒中后2周 BDNF平均甲基化水平与Val66Met基因多态性的交互作用对PSA的易感性有关(P<0.05)。详见表4。

表4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多态性对PSA易感性的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

PSA是一种多因素影响的疾病，主要受生物学和表观遗传基因调控，其中BDNF基因表达的高低与PSA易感性有关[1]。既往研究表明，DNA甲基化水平调控BDNF基因的表达，高甲基化状态与BDNF基因的低表达密切相关[10]。BDNF是各种神经元发育和生存所必需的营养物质，在神经突触可塑性和长时程记忆中发挥着重要作用，参与焦虑症发生的病理生理学机制[1]。本研究通过建立脑卒中队列，探讨BDNF基因甲基化水平、Val66Met基因多态性及其相互作用与焦虑发生的关系，结果显示，脑卒中后2周病人(急性期)中PSD、后循环脑卒中、BDNF Val66Met基因多态性中met/met基因型的脑卒中病人更易患PSA；脑卒中后1年的PSA病人(慢性期)患病率明显升高，女性、PSD、高血压、BDNF基因CpG2、CpG9位点及平均CpG甲基化高水平病人更易患PSA。

大量动物模型和群体队列研究表明，BDNF基因中高甲基化水平与焦虑发生有关[1，11-12]。本研究结果显示，BDNF基因的高甲基化水平与PSA发生率有关。虽然本研究未检测BDNF基因的表达量，但以往研究证实，PSA病人存在较低的BDNF基因表达水平，BDNF水平的降低可能会干扰脑卒中病人的杏仁核和海马区对恐惧情绪的处理，使脑卒中病人长期处于高度紧张状态，逐渐出现脑卒中后焦虑症状[3，10]。情绪稳定剂和心理治疗方法在内的干预治疗有助于降低BDNF的高甲基化水平，且治疗前甲基化状态越高，治疗效果越好[1]。在本研究中，脑卒中后1年的PSA病人BDNF基因存在较高的甲基化水平，而BDNF Val66Met基因多态性中met/met基因型与脑卒中后2周的PSA的发生有关，脑卒中后1年PSA发生的风险与BDNF甲基化水平变化有关，而与BDNF基因多态性无关。影响焦虑的机制有：①慢性压力(残疾、失业、经济压力等)可引起脑循环糖皮质激素水平升高，干扰BDNF基因的表达，加剧焦虑的发生，BDNF甲基化水平可能仅在脑卒中后1年对焦虑的发展起直接作用，如BDNF基因甲基化水平与海马回结构神经环路相关，此部位主要参与焦虑形成相关的恐惧情绪的调节以及记忆巩固、恢复调节的重要部位，主要参与应激反应情绪的调节与BDNF mRNA水平的调节[1，14-15]；②在脑卒中急性期(2周内)，生物因素的变化导致脑卒中病人产生代偿性或适应性应激反应，BDNF的变化可能增加PSA的风险。已有研究表明，Val66Met基因多态性对焦虑的发生具有易感性，目前的研究表明，BDNF基因多态性在脑卒中病人慢性期的焦虑症状中并不具有相关性，但脑卒中后2周PSA的发生可能与BDNF高甲基化水平及Val66Met基因多态性中met/met基因型的共同作用有关，两者都降低BDNF基因的表达，未来仍需要进一步扩大脑卒中样本来研究BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多态性与焦虑发生的关系[16]。

本研究通过对BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多态性与PSA易感性的研究发现，BDNF基因甲基化水平改变可作为PSA发生的易感性潜在生物标志物，应密切监测BDNF基因平均甲基化水平较高的脑卒中病人，以确定焦虑的发生情况，特别是在脑卒中后的慢性期。而在脑卒中的急性期中，具有Val66Met基因多态性中met/met基因型的病人也应密切关注其焦虑的发生情况。由于目前BDNF甲基化水平与Val66Met基因多态性检测相结合是相对无创的，且随着时间的推移，这些值的变化在生物学上是稳定的，通过简单的实验室指标检测有助于确定脑卒中病人PSA发生的风险。此外，药物治疗如使用DNA甲基化抑制剂可以逆转甲基化水平，具有明显的抗焦虑作用，有助于开发针对PSA治疗的新靶点药物。