黄角颗粒预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制

熊 岳，李铁成

急性心肌缺血是由多种原因引起的心脏血液灌注急剧减少或中断，导致心脏供氧能力下降，心肌能量代谢异常，心脏不能正常工作的病理生理状态。当心肌发生急性缺血缺氧时，临床主要表现为胸闷、胸痛、气短、心悸、大汗等症状，严重时甚至出现呼吸困难。通过治疗可以使闭塞的冠状动脉再通，缺血的心肌重新得到灌注，濒临坏死的心肌得以存活，损伤及坏死范围缩小，减轻梗死后心肌重塑。但是再灌注治疗有利也有弊，尽管再灌注获益显著，但血流的恢复和再供氧的最初几分钟内常常加重了组织损伤和炎症反应，这种现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI)。中药治疗心肌缺血再灌注损伤因不良反应低、疗效确切，作用于疾病的多个环节而倍受重视，黄角颗粒是对脑缺血再灌注损伤具有明确保护作用的药物[1]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取体质量220～250 g的SD雄性大鼠30只，大鼠均由锦州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCKK(辽)2009-0004，正常饲喂3 d。

1.2 实验试剂 本实验所用黄角颗粒由大黄和水牛角两味中药按1∶2比例配制(锦州市中心医院中医科制剂室配制)；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、兔抗人p-JAK2多克隆抗体、兔抗人p-STAT3单克隆抗体均购自美国Amresco公司；苏木精-伊红(HE)染色、NBT染色试剂购自金克隆(北京)生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血清超氧化物歧化酶(SOD)和血浆丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量检测试剂盒购自上海酶联生科技技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 30只大鼠正常饲养3 d，确定进食、活动及精神状态均无异常后，随机分为假手术组、模型组及黄角颗粒组，每组10只。假手术组和模型组每天以10 mL/kg生理盐水灌胃1次，连续灌胃5 d；黄角颗粒组每天以10 g/kg黄角颗粒溶液灌胃1次，浓度1 g/mL，连续灌胃5 d。

1.3.2 模型制备 实验周期结束后的当天晚上给予大鼠禁食不禁水，第2天称重。将大鼠仰卧位固定于实验架上，腹腔注射20%乌拉坦全身浸润麻醉，气管插管，连接呼吸机，调节呼吸机参数(呼吸频率55次/min，每100 g潮气量1.5 mL)，同时将针形电极插入大鼠四肢皮下，连接心电图机记录心电图，记录标准Ⅱ导联心电图。开胸，充分暴露心脏，分离左冠状动脉前降支，除假手术组只开胸不行冠状动脉结扎外，其余各组将冠状动脉前降支前端用无创伤缝合线结扎[2]。结扎30 min后，予再灌注治疗60 min。结扎冠状动脉前降支后见Ⅱ导联心电图ST段抬高，恢复心肌灌注后ST段回落50%以上为大鼠心肌缺血再灌注模型造模成功的标志。

1.3.3 血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量检测 大鼠再灌注时间结束后，每只大鼠右心房取血，血液冰上静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，将上层血清置于-80 ℃冰箱中备用。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量。

1.3.4 心肌梗死面积测定 取血完成后，取下大鼠心脏，去除心房及右心室后将残余心肌组织放入冰箱中，-20 ℃条件下冷冻1 h，待组织变硬后取出，于冠状动脉结扎线下沿平行于冠状沟方向将心肌组织切成等厚的5片，再放入0.1% 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液中，在37 ℃水浴锅中摇动染色10 min。正常心肌经NBT染色后为暗紫色，梗死部位心肌经染色后为红色或苍白色，粗略估算心肌梗死面积。

1.3.5 TNF-α测定 在大鼠TNF-α单克隆抗体的酶标孔中加TNF-α温育。温育后加入生物素标记的抗TNF-α抗体，与链霉亲和素-HRP结合形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，加入底物A和B后变成蓝色，而后在酸的作用下转化成最终的黄色。TNF-α浓度越高，颜色越深。放射免疫测量法测量TNF-α水平。

1.3.6 p-JKA2和p-STAT3检测 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测p-JKA2和p-STAT3水平。取保存于-80 ℃的各组心肌组织100 mg，严格按照抗体使用说明书的操作方法检测蛋白水平并拍照保存结果。成像结果采用Image J 分析。

2 结 果

2.1 3组心肌梗死面积比较 假手术组均为正常心肌，模型组心肌梗死面积明显增大，黄角颗粒组心肌梗死面积与模型组比较呈下降趋势。详见图1。

图1 3组心肌梗死面积比较

2.2 3组血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比较 与假手术组比较，模型组血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明显升高，SOD活性明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，黄角颗粒组血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明显下降，SOD水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 3组血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比较 ()

2.3 3组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显增加(P<0.05)；与模型组比较，黄角颗粒组大鼠心肌组织中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显增加(P<0.05)。详见图2、图3。

模型组与假手术组比较，＊ P<0.05；黄角颗粒组与模型组比较，# P<0.05

模型组与假手术组比较，＊ P<0.05；黄角颗粒组与模型组比较，# P<0.05

3 讨 论

黄角颗粒是由大黄和水牛角两味中药的破壁粉剂按照1∶2的比例配置而成，中药大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效；水牛角是中药犀角的代用品，具有清热解毒、凉血定惊的功效，二者合用有通腑解毒、凉血定惊之功效[3-4]。陈国华等[5]观察黄角颗粒对大脑中动脉栓塞的大鼠血浆中炎性因子的变化发现，经过提前给予黄角颗粒的大鼠与模型组比较，血清MDA、TNF-α、NO水平明显降低，SOD水平有所升高，提示黄角颗粒可以有效清除氧自由基，减轻自由基对缺血大脑的进一步损伤。潘宋斌等[3]通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，发现经过黄角颗粒预处理的大鼠与模型组比较，不仅可以抑制炎症反应，还可以使脑组织中的cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9和Bax的表达降低，说明黄角颗粒对脑缺血再灌注损伤的保护作用还与减少细胞凋亡有关，而黄角颗粒在心肌缺血再灌注损伤中的应用鲜有报道。

心肌缺血再灌注损伤是指发生急性缺血的心肌在重新恢复血液灌注后，心肌细胞损伤反而加重，损伤范围进一步扩大，同时影响心脏的功能、代谢和结构。研究发现，可能与氧自由基的产生增多、细胞内钙超载、炎症反应及细胞凋亡有关[6-8]。本研究从黄角颗粒减轻脑缺血再灌注损伤出发，进一步证实其对心肌缺血再灌注损伤具有同样的保护作用。cTn及心肌酶谱是判定心肌损伤及坏死最常用的生化指标，cTn包括cTnC、cTnI和cTnT 3个亚型，其中cTnI仅存在于心肌，有100%的心肌特异性[9]。心肌酶谱是判定心肌坏死敏感性较高的特异性生化指标，CK-MB不仅可以用于判断心肌梗死，同时可以判定溶栓治疗后梗死相关的动脉是否再通。本实验发现，发生心肌缺血再灌注损伤后大鼠血清中的cTnI及CK-MB水平明显升高(P<0.01)，而经过黄角颗粒预处理后的大鼠能够明显降低血清cTnI及CK-MB水平(P<0.05)，可有效减少酶类物质释放入血，降低缺血再灌注后的心肌损伤。自由基的异常增多在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中发挥着十分重要的作用。在正常生理状态下，SOD等抗氧化酶作为人体内关键的氧自由基清除剂，能有效清除超氧自由基，使其转变成氧分子和水，当心肌发生急性缺血时，SOD活性减弱，体内氧自由基无法迅速清除，氧自由基的不断堆积使生物膜发生脂质过氧化反应，导致一系列脂质自由基和降解产物MDA的产生，致使心肌细胞受损，加重细胞结构及功能障碍，因此，细胞内SOD的活性以及MDA含量能够准确反映氧自由基的含量，是判断细胞损伤程度的标志[10]。本研究结果显示，经黄角颗粒预处理的大鼠较模型组SOD含量明显增加(P<0.05)，MDA含量明显下降(P<0.05)，说明黄角颗粒能够有效清除氧自由基，减少炎性因子的释放，降低炎症反应，减少心肌细胞损伤。TNF-α等炎性因子的大量释放可反馈性产生氧自由基，导致氧自由基堆积，细胞结构和功能受损。TNF-α由巨噬细胞产生，是参与炎症反应的重要因子，缺血再灌注时大量表达与分泌，并可通过自分泌方式作用于其他巨噬细胞，引起更多巨噬细胞的活化，从而放大炎症反应，其表达水平快速升高，进一步诱导细胞坏死，加重心肌组织损伤[11-12]。本研究结果显示，发生心肌缺血再灌注损伤后大鼠血清中TNF-α水平明显增高(P<0.01)，经过黄角颗粒预处理后的大鼠血清TNF-α水平明显减少(P<0.05)，减轻缺血再灌注损伤。

JAK/STAT信号通路是调控细胞免疫、增殖、分化、凋亡等多种病理生理过程的重要细胞内信号转导通路[13]。大量研究表明，JAK2/STAT3信号通路是炎症反应中的经典通路，可通过对下游众多靶点发挥调控作用，如糖原合成酶激酶3、核转录因子κB、内皮型一氧化氮合酶以及TNF-α等[14-16]。发生急性心肌缺血后，可快速导致JAK2和STAT3磷酸化，从而使 JAK/STAT信号通路激活，并发挥内源性心肌保护作用。本研究结果表明，给予黄角颗粒药物组大鼠的p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平表达明显增加，说明黄角颗粒能够激活JAK/STAT信号通路的传导，从而对缺血后的心肌起到一定保护作用。