利用Connectivity Map数据库筛选抗菌药物的初步研究

刘曼莉，舒 芬，张亚妮，方 伟，王开梅，吴兆圆

（湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064）

细菌性传染病是威胁人类和动物健康的重要病原，自20世纪20年代抗生素的发现到现在，抗生素仍是解决细菌性传染病的重要手段，然而耐药性问题急需新型抗细菌感染的策略和药物。

Connectivity map（Cmap）是Lamb等［1］利用1千多个小分子药物处理人类细胞后获得的超过7 000个全基因组表达谱的数据库。研究人员利用Cmap研究新化合物的活性、推论药物的主结构与药理作用、找到疾病治疗的新靶点。Gao等［2］发现celastrol和withaferin可作为化学伴侣和抗肥胖药物；Dyle等［3］发现番茄碱可治疗骨骼肌萎缩；Dudley等［4］发现托吡酯治疗炎症性肠病；Brum等［5］发现丁苯咪唑是治疗骨关节炎的重要药物等。Connectivity map是一个老药新用、研究新化合物活性、筛选新靶点潜在的有广泛应用前景的工具。

生物碱类化合物广泛存在于动植物中，是一类含氮杂环的有机物，具有碱性和显著的生理活性，是重要的天然产物之一。目前已鉴定的生物碱有超过2万个，一些生物碱因其抗肿瘤、抗菌和抗病毒活性，及低毒性、低成本成为研究的热点。

本研究通过Cmap数据库筛选潜在抗菌活性化合物的过程中，筛选到石蒜碱（Lycorine）、左旋水苏碱（Betonicine）、玫瑰树碱（Ellipticine）3个生物碱类化合物具有潜在抗菌活性，并对它们的抑菌活性及抗溶血活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）ATCC 27853、金黄色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）ATCC 25923由湖北省生物农药工程研究中心保存，猪丹毒杆菌（Ery⁃sipelothrix rhusiopathiae）WH13013、猪链球菌（Strep⁃tococcussuis）SC19由华中农业大学谭臣教授课题组提供。

1.2 试剂

大肠杆菌使用LB培养基，由酵母粉、胰蛋白胨和氯化钠按配方配制，固体培养基是在LB中加入琼脂粉。酵母粉和胰蛋白胨购自OXOID公司，氯化钠和琼脂粉购自国药集团化学试剂有限公司。

绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪链球菌使用含10%小牛血清的TSB和TSA培养基。TSB和TSA培养基购自BD Difco公司按配方配制，小牛血清购自杭州四季青生物有限公司。

石蒜碱（B21169，≥98%）和头孢匹罗（Cefpirome sulfate，S25863，98%）购自上海源叶生物科技有限公司。左旋水苏碱（ZES-0605，N/A）购自法国EXTRA⁃SYNTHESE公司。玫瑰树碱（T4614，98.85%）、青霉素（Ampicillin，T0814L，99.27%）和链霉素（Strepto⁃mycin sulfate，0060，720IU）购自上海陶素生化科技有限公司。石蒜碱、左旋水苏碱和玫瑰树碱均使用DMSO溶解，青霉素、链霉素和头孢匹罗用无菌水溶解，化合物的储存浓度均为10 mg/mL，试验时使用细菌培养基LB或TSB稀释成相应的使用浓度，同时设立DMSO和水的阴性对照孔。

绵羊红细胞购自广州鸿泉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Connectivity map数据库分析 将猪链球菌感染THP-1细胞中的差异表达基因（accession num⁃ber：GSE20508）分别以UP和DOWN文件输入Con⁃nectivity map数据库，除去不能识别的数据，进行分析，获得6 100个化合物的Connectivity score，从Con⁃nectivity score为负的数据中进行挑选。

1.3.2 药物最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用美国临床和实验室标准委员会（CLSI 2012）推荐的微量肉汤稀释法进行。将纯化的细菌划线接种于LB或TSA固体培养基上，37℃培养24 h，挑取单菌落接种于LB或TSB液体培养基中，于37℃、200 r/min摇床振荡培养12 h。将菌液按1∶1 000的比例接种于LB或TSB液体培养基，于37℃、200 r/min摇床振荡培养至OD600nm约为0.5（菌量约为1×108CFU/mL），再将菌悬液1∶100稀释后备用。在96孔培养板中每孔加入50μL倍比稀释不同浓度的药物，加入50μL稀释的菌液，每种药物每株菌3次重复，同时设阴性对照和阳性对照。对照药物选择青霉素、链霉素和头孢匹罗。置于37℃温箱中孵育16～20 h，读取测定结果。

肉眼观察微量稀释孔中以无细菌生长现象的最高药物稀释浓度为该药物对该种细菌的药物最小抑菌浓度。平行操作3次，以3次结果的平均值作为此药对该细菌的MIC。

1.3.3 药物抗溶血试验 细菌于相应的液体培养基中培养过夜（37℃摇床220 r/min），1∶500扩大培养4 h至对数生长期，分装成3 mL/细菌瓶，加入不同浓度的药物，继续培养5 h。取1 mL培养物离心（10 000 r/m，1 min）收集上清液，取150μL上清液于96孔板中，加入2%绵羊红细胞150μL，同时分别做加入150μL的LB或TSB的阴性对照和加入150μL 1%Triton X-100的阳性对照，于37℃作用2 h，8 000 r/min离心10 min。将150μL上清液移到新的96孔板中，用分光光度计测定OD540nm。样品的溶血百分比=［（样品OD540nm-阴性对照OD540nm）/（阳性对照OD540nm-阴性对照OD540nm）］×100%。

2 结果与分析

2.1 Connectivity map数据库分析及抗菌化合物挑选

将猪链球菌感染THP-1细胞结果中的差异表达基因按Connectivity map网站的要求，分别以UP和DOWN的文件输入数据，通过分析，获得化合物的相关Connectivity值，共有1 685个化合物Connec⁃tivity值为负值。筛选出石蒜碱、左旋水苏碱和玫瑰树碱等3个具有潜在抗菌活性的生物碱类化合物，相关结果见表1。

表1 3个化合物的Connectivity map分析结果

2.2 抗菌活性研究

将3个化合物与5株菌作用，研究化合物对G+和G-菌的抑菌情况，同时使用青霉素、链霉素和头孢匹罗作为阳性对照。由表2可知，玫瑰树碱对4种菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪丹毒杆菌和猪链球菌均有抑菌效果，且MIC与链霉素效果相当或更优。左旋水苏碱和石蒜碱对5株菌均无明显的抑菌效果。

表2 化合物的MIC结果

2.3 药物抗细菌溶血活性

为了研究菌株的溶血活性，将5株菌分别培养6、12、24 h，离心取上清液与红细胞在37℃共培养2 h，由表3可知，金黄色葡萄球菌和猪链球菌有较强的溶血活性。

表3 5株菌的溶血活性

将3个化合物与金黄色葡萄球菌和猪链球菌共作用12 h，取上清液与红细胞进行溶血试验。由图1可以看出，玫瑰树碱对2株菌均有明显的抑制溶血活性。石蒜碱和左旋水苏碱在64μg/mL对2株菌无明显抑制溶血活性。

图1 玫瑰树碱抑制金黄色葡萄球菌和猪链球菌的溶血活性

3 讨论

本研究利用猪链球菌感染的THP-1芯片信息，通过Cmap数据库分析，获得化合物的相关信息，从中挑选了石蒜碱、左旋水苏碱、玫瑰树碱3个生物碱类化合物进行抗菌活性研究。结果表明，石蒜碱和左旋水苏碱对5株菌没有明显的抑菌活性。玫瑰树碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪链球菌均有明显的抑菌作用，但对绿脓杆菌没有明显的抑菌作用。而且玫瑰树碱能抑制金黄色葡萄球菌和猪链球菌的溶血活性，说明玫瑰树碱具有广谱的抗菌、抗溶血活性。

玫瑰树碱是一种吲哚并异喹啉类生物碱，主要是从夹竹桃科玫瑰树属植物古城玫瑰树（Ochrosia elliptica）的叶中分离出的天然生物碱［6，7］，玫瑰树碱及其类似物具有抗肿瘤、抗病毒［8-10］及抗菌活性。玫瑰树碱对猪链球菌和大肠杆菌有较好的杀菌作用，并能很好地抑制猪链球菌的溶血活性，减轻猪链球菌导致的小鼠肺损伤［11，12］。有研究表明，玫瑰树碱的衍生物对角叉菜胶致大鼠多发性关节炎具有保护作用［13］，也可以削弱脂多糖（LPS）诱导的急性肺炎［14］等。玫瑰树碱的季铵盐是D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶抑制剂，是细菌细胞壁合成必需的胞内酶［15］。玫瑰树碱的作用机制主要包括DNA嵌入、抑制拓扑异构酶Ⅱ、大分子共价烷基化和诱导内质网压力等［16-20］。

生物碱是一类含氮杂环的有机物，已知的生物碱有上万种，主要存在于植物中。生物碱类化合物有较强的生理活性，是中草药中重要的有效成分之一。石蒜碱属生物碱，具有抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗肿瘤等多方面的作用［21-26］。研究发现石蒜碱抗肿瘤机制可能是通过干扰DNA的模板功能，影响DNA转录过程，从而抑制RNA的合成［27，28］。而且石蒜碱能抑制P38和STATs的激活并降低LPS诱导的炎症反应及小鼠死亡率［29］。左旋水苏碱是益母草的主要活性成分之一，能拮抗LPS所致的病理损伤［30］。左旋水苏碱的研究并不多，但有研究发现左旋水苏碱能参与抑制细菌根瘤农杆菌（Agrobacterium tume⁃faciens）的群体效应［31，32］。

本研究中Cmap的筛选结果里包含了玫瑰树碱、石蒜碱和左旋水苏碱。玫瑰树碱有较好的抗菌和抑制溶血的活性，但石蒜碱和左旋水苏碱的直接杀菌和抑制溶血作用不明显。因此，Cmap在药物筛选过程中有重要的应用价值，但仍需要通过试验进行验证。