不同染色方法对两种禾本科牧草菌根侵染率的影响

2022-01-08张海娟芦光新范月君周华坤周学丽窦声云颜珲璘赵阳安

草地学报 2021年12期

张海娟，芦光新*，范月君，周华坤，周学丽，窦声云，颜珲璘，马坤，赵阳安

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016； 2.中国科学院西北高原生物研究所，青海省寒区恢复生态学重点实验室，青海西宁 810008； 3.青海省草原改良试验站，青海共和 813000;4.青海农牧科技职业学院，青海湟源 812100)

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌能与禾本科(Graminoids)、豆科(Leguminosae)、莎草科(Sedges)等植物互作形成菌丝(Hyphae)、泡囊(Vesicles)、孢子(spore)、丛枝(Arbuscular)等菌根结构[1]。菌根在调控植物株高和生物量[2-4]，促进植物根系发育和对氮磷等养分的吸收[5-8]，增强植物对低温[9]、干旱[10]、盐碱[11-12]及重金属[13-14]等非生物胁迫的抵抗和耐受能力，以及改善土壤养分状况及修复严重污染的土壤等方面发挥着重要的作用[15-16]。近年来，由于受到气候变化和人类活动等干扰，大面积高寒草地出现不同程度退化，丛枝菌根真菌也被逐渐用于退化高寒草地恢复治理中，而适宜的草种和菌种是退化高寒草地植被和土壤得以恢复的必要物质基础[17]。禾本科牧草如‘川草2号’老芒麦(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿坝’垂穗披碱草(Elymusnutans‘Aba’)等因具有抗寒、耐贫瘠等特点，是高寒地区人工草地建植、天然草地补播改良和退化草地恢复治理中重要的牧草资源[18-20]。

菌根侵染率表示植物受AM真菌侵染的程度，其检测值会受染色效果的影响[21]，检测菌根侵染率常用的染色方法有酸性品红、台盼蓝和墨水醋染色法。不同研究者因植物种类等不同而采用了不同的染色方法，其菌根观测效果亦有所差异。房凤如[22]、景跃波等[23]和晏梅静等[24]用台盼蓝分别染色杨树(Populus)、杉木林(Cunninghamialanceolata)和桑树(Morusalba)根部的AM真菌后，能观察到孢子、菌丝和泡囊等结构；毛圆圆[25]、蔡柏岩等[26]、邵金诚等[27]和李文彬等[28]用酸性品红分别染色香根草(Vetiveriazizanioides)，黄檗(Phellodendronamurense)，甘蔗(Saccharumofficinarum)和高羊茅(Festucaarundinacea)根系AM真菌后，也能清晰观察到菌丝、孢子和泡囊结构；汪茜等[29]和廖楠等[30]用墨水醋染色生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)和甘蔗根系AM真菌后，亦能清楚观察到菌丝、泡囊和孢子结构。

目前，对禾本科牧草接种AM真菌检测菌根侵染效应的研究已有很多，涉及的禾本科牧草有早熟禾(Poapratensis)[31-32]、黑麦草(Loliumperenne)[33-36]、狗牙根(Cynodondactylon)[37]、狼尾草(Setariaviridis)[38]、羊草(Leymuschinensis)[39]、冷蒿(Artemisiafrigida)[40]、高羊茅(Festucaarundinacea)[12]等，但未见对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草接种AM真菌的研究。为此，本研究通过对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草接种根内球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)，探讨2种禾本科牧草与AM真菌的共生情况，同时探讨了酸性品红、台盼蓝和墨水醋3种染色方法对菌根侵染率的影响，以期为禾本科牧草菌根侵染率的测定提供技术指导，同时也为“植被-微生物”联合生态修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1禾本科牧草试验材料为环青海湖地区引种的‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草，购自四川省草原科学研究院。播种前，供试牧草种子均用10%H2O2消毒10 min，无菌水清洗干净后用滤纸吸干水分备用。

1.1.2供试菌剂供试AM真菌为由长江大学吴楚教授馈赠的根内球囊霉和摩西球囊霉，均为包含根段、丛枝、菌丝和孢子等的混合物。

1.1.3培养基质培养基质为青海大学农牧试验田壤土和河沙(3∶1)的混合物，养分含量见表1，经高压蒸汽灭菌后使用(121℃，2 h)。

表1 试验田土壤养分含量

1.1.4培养盆钵培养盆钵为规格18 cm × 15 cm × 13 cm(上口径×下口径×高)的塑料花盆，使用前用75%酒精反复擦拭消毒。

1.1.5染色剂酸性品红：0.15 g酸性品红+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸馏水；台盼蓝：0.05 g台盼蓝+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸馏水；墨水醋：5 mL Quink牌纯黑墨水+ 95 mL家用白醋。

1.2 试验设计

试验设置接种根内球囊霉(GI)、接种摩西球囊霉(GM)和不接种(Control check，CK)3个处理，每个处理4次重复，每种牧草有12盆，共有24盆，随机排列，隔天依次调换花盆位置，确保各盆所处的培养条件一致。称取400 g灭菌基质装于经消毒处理的塑料花盆中，喷洒适量无菌水，准确称取10 g供试AM真菌菌剂均匀的铺撒于上面，覆盖60 g灭菌基质，每盆浇100 mL无菌水，然后以30粒每盆的播种密度分别播种2种禾本科牧草种子，覆土40 g后再次喷少量无菌水，出苗7 d后间苗并定苗至20株每盆。盆栽试验在青海大学农牧实验楼草地微生物实验室进行，栽培周期为2个月(2021年1月13日至2021年3月13日)。试验期间，自然采光，白天温度为(25±2)℃，夜间(19±2)℃。

1.3 测定指标

1.3.1孢子密度栽培2个月后，每个处理随机称取20 g风干后混匀的根际土，采用湿筛倾析-蔗糖离心法式和光学显微镜下观察孢子形态并用直接计数法计数

1.3.2菌根侵染率取1 g宿主植物的新鲜根样，抖落根际土后轻轻地用水漂洗干净，剪成1 cm左右的根段，置于甲醛-乙酸-乙醇固定液(Formaldehyde acetic acid，FAA)中固定过夜，次日取出适量根系洗净后分别用台盼蓝、酸性品红和墨水醋染色法进行染色[27]。染色完成后随机选取10条根段，完成制片，3次重复。做好的压片通过光学显微镜观察孢子、菌丝、泡囊等菌根结构，染色质量较好的压片在荧光显微镜下拍照，然后按Biermann等的方法计算菌根侵染率[41]。

1.4 数据分析

用Excel软件整理数据，用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 孢子密度

通过湿筛倾析-蔗糖离心法分离获得的孢子在体式和光学显微镜下的形态如图1所示。可以看出，两种AM真菌孢子形态多为不规则球形，浅黄至黄褐色。直接观测计数后分析发现，不接种的对照处理均无孢子出现(图1a，1 d)，而接种的处理均能分离出孢子(图1b，1c，1e，1f)。‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草分别接种根内球囊霉和摩西球囊霉2个月后，‘川草2号’老芒麦根际孢子密度分别为119个·(20 g)-1和145个·(20 g)-1，‘阿坝’垂穗披碱草根际孢子密度分别为63个·(20 g)-1和74个·(20 g)-1，且‘川草2号’老芒麦接种处理的孢子密度显著高于‘阿坝’垂穗披碱草(P<0.05)(表2)。

图1 2种AM真菌接种处理下2种禾本科牧草根际孢子显微形态

表2 接种对2种禾本科牧草根际孢子密度的影响

2.2 不同染色方法对菌根侵染率的影响

2.2.1台盼蓝染色的菌根结构观测效果由图2可知，用台盼蓝染色法对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草根系的根内球囊霉和摩西球囊霉进行水浴加热染色后，除了对照外，均能清晰的观察到根皮层AM真菌的泡囊、孢子和菌丝结构，说明台盼蓝染色剂利于泡囊等菌根结构着色，利于菌根结构的观察。可以看出，未接种AM真菌的处理无菌根侵染的迹象(图2A，2D)，而接种的处理则被不同程度侵染(图2B，2C，2E，2F)。

图2 台盼蓝染色剂对2种禾本科牧草根系2种AM真菌的染色效果

2.2.2酸性品红染色的菌根结构观测效果用酸性品红对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草根系的根内球囊霉和摩西球囊霉染色后发现，除了不接种的对照处理外(图3A，3D)，在光学显微镜下均能较为清晰的观察到泡囊、菌丝等菌根结构(图3B，3C，3E，3F)，但其效果略次于台盼蓝染色剂染色的效果。因此，在实际研究中，可根据试剂的存储情况等进行选择。2种染色剂也可以交叉使用，视觉效果会更佳。

图3 酸性品红染色剂对2种禾本科牧草根系2种AM真菌的染色效果

2.2.3墨水醋染色的菌根结构观测效果使用5%的墨水醋染色剂对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草根系的根内球囊霉和摩西球囊霉染色后发现，在光学显微镜下很难观察到菌根结构(图4)，随后进行的多次染色试验效果亦是如此。可见，墨水醋染色法对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草根系的根内球囊霉和摩西球囊霉的染色效果差，会影响菌根侵染率的测定，实际研究中应慎选。

图4 墨水醋染色剂对2种禾本科牧草根系2种AM真菌的染色效果

2.2.4不同染色方法对菌根侵染率的影响 3种染色方法对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草菌根侵染率的影响存在差异(表3)。用台盼蓝染色后，根内球囊霉对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率分别为66.3%和55.3%，摩西球囊霉对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率分别为71.3%和73.3%；用酸性品红染色后，根内球囊霉对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率分别为63.0%和49.1%，摩西球囊霉对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率分别为65.3%和63.0%；而用墨水醋染色的菌根侵染率均为0。经分析，根内球囊霉和摩西球囊霉对‘川草2号’老芒麦的菌根侵染率之间差异不显著，对‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率之间差异显著(P<0.05)；台盼蓝和酸性品红染色法对2种禾本科牧草菌根侵染率的影响差异均不显著，与墨水醋染色的菌根侵染率之间差异显著(P<0.05)。

表3 3种染色方法对2种禾本科牧草菌根侵染率的影响

3 讨论

3.1 不同AM真菌对不同植物的接种效应

本研究结果显示根内球囊霉和摩西球囊霉对‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的菌根侵染率存在差异，这可能是由这2种禾本科牧草对菌根的依赖性不同所致，也可能是因为2种牧草根部产生的分泌物对2种AM真菌的刺激程度不一样引起的。许多相关研究与本研究结果一致，如肖雪毅等对黑麦草(Loliumperenne)分别接种3种不同的AM真菌后侵染率分别为2%，14%和3%[35]；杨婷等对紫花苜蓿(Medicagosativa)和黑麦草分别接种苏格兰球囊霉(Glomuscaledonium)后紫花苜蓿菌根侵染率大于黑麦草[36]；王丽萍等测得摩西球囊霉对黑麦草的菌根侵染率在33.33%～66.67%之间[15]；冯海艳等用摩西球囊霉和根内球囊霉分别接种黑麦草后测得菌根侵染率分别为34%和38%[42]。这些研究结果都表明，不同AM真菌对黑麦草的侵染率存在差异。马放等用摩西球囊霉和根内球囊霉分别接种早熟禾(Poapratensis)后，测得菌根侵染率分别为49.49%和41.81%[31]；杨海霞等用2种不同的AM真菌分别接种高羊茅(Festucaarundinacea)和草地早熟禾发后发现菌根侵染率草地早熟禾>高羊茅，分别为17.0%，19.5%和57.7%，39.4%[12]；王立等对早熟禾分别接种了根内球囊霉和摩西球囊霉后发现摩西球囊霉的菌根侵染率高于根内球囊霉，分别为35.71%和43.27%[32]。可见，早熟禾的菌根侵染率也因AM真菌类型不同而呈现差异。对其他植物的菌根侵染率亦是如此，如贾振宇等对羊草(Leymuschinensis)分别接种摩西球囊霉和地表多抱囊霉(Diveversiforme)后测得菌根侵染率分别为17%和56%[10]；叶少萍等对狗牙根(Cynodondactylon)接种摩西球囊霉和聚丛球囊霉(Glomusaggregatum)后菌根侵染率为49.50%和58.01%[37]；宁楚涵等对芦苇(Phragmitescommunis)和狼尾草(Pennisetumalopecuroides)接种摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和根内根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)后测得菌根侵染率分别为55.3%，52.7%和46.4%，44.6%[38]。以上研究结果表明，不同AM真菌对同种或不同植物的菌根侵染率存在差异。

3.2 不同染色方法对不同植物根系AM真菌的染色效果

通过对比台盼蓝、酸性品红和墨水醋染色的效果发现，台盼蓝和酸性品红染色的效果明显优于墨水醋染色的效果。用前2种染色方法染色，AM真菌的孢子、菌丝和泡囊着色效果很好，便于观察菌根结构和测定侵染率。这一方面可能跟植物的根系结构相关，如根的坚韧程度。栽培2个月的‘川草2号’老芒麦和‘阿坝’垂穗披碱草的根系较为细嫩，用10%KOH溶液透明处理1 h后，牧草根部皮层细胞中的细胞质基本清除干净，极大的方便了染色剂的渗透[21]，因此孢子等更容易着色。其他研究者也做了相关研究，如娄璇[43]采用台盼蓝对水稻根系AM真菌染色后，能清晰观察到根内菌丝和泡囊以及根细胞内形成的丛枝结构；而刘晓迪等[44]同样采用台盼蓝对番茄(Solanumlycopersicum)根段染色后菌根观测效果却一般；蔡柏岩等[26]采用酸性品红对黄檗根围AM真菌染色后菌根观测效果不佳。另一方面可能跟水浴加热透明和染色的时间有关。本研究对供试材料在处理时间上控制到位，因此观测效果较好。房凤如[22]采用台盼蓝对杨树根部AM真菌进行了过夜染色，结果能清晰观察到孢子、菌丝和泡囊等结构。毛圆圆[25]对香根草根系AM真菌用酸性品红染色后静置过夜，次日在香根草根系中可以观察到AM真菌的侵入点、菌丝、泡囊和丛枝等结构。可见，染色时间也是影响染色效果的关键因素之一，把控好染色时间可以改善观测效果。

用墨水醋染色后，本研究很难观察到任何菌根结构。然而，汪茜等[29]，廖楠等[30]同样采用了墨水醋染色法，却能清楚观察到生姜和甘蔗根系AM真菌的菌丝等菌根结构。这可能是因为墨水醋染色法适用于生姜、甘蔗等根系相对坚韧的植物根系的AM真菌的染色，而本研究所选的宿主植物根系幼嫩，因而导致孢子、泡囊等着色困难，进而影响了染色质量；也有可能是染色时间或者墨水质量的问题。