细毛羊细管冷冻精液制作技术研究

文│唐淑红 吴建 李凤珍（新疆维吾尔自治区阿克苏地区畜牧技术推广中心）

中国美利奴（新疆型）细毛羊的羊毛产量和质量已达到国际同类细毛羊的先进水平。德国美利奴细毛羊属于肉毛兼用细毛羊具有生长育速度快、成熟早、产肉率高、肉质好、被毛白而长、品质好等优良特性，是细毛羊中优秀的品种。精液冷冻保存技术可使优质种羊精液不受时间与空间限制，对实现优良品种遗传资源传承有着重要的意义。自1949年来甘油被英国科学家用于冷冻精液保存并取得较好成效，随后精液冷冻技术不断发展，绵羊精液冷冻效果有所提升，但冷冻效果受地区、物种、品种等不同因素的影响，特定地区的绵羊精子冷冻稀释液配方及制作方法还需进一步完善。

一、材料

1.试验动物。选择品种特征明显、生长发育良好、性欲较强、身体健康的中国美利奴（新疆型）细毛羊和德国美利奴细毛羊的种公羊各5只作为采精公羊。

2.试验器材。半自动精液分装机（KHF labopart），显微镜（显峰XSP-6C-1600X），数显恒温水浴锅（金威HH-1）。

3.试验药品。葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸药品为分析纯，购自天津市盛奥化学试剂有限公司；甘油购自天津永晟精细化工有限公司；卵黄来源于市场的新鲜鸡蛋；CASSOU吸管0.25毫升；CASSOU封口粉等。

4.数据统计分析。采用SPSS18.0统计软件，试验数据用平均数±标准差表示，方差分析检验差异显著性。

二、方法

1.采精与品质鉴定。在试验开始前1个月左右对选取的种公羊进行适当补饲、强化管理。采精时选择发情母羊作为台羊，使用假阴道法采集精液，采精量0.5～2毫升/只。先选择乳白色、略带腥味、无杂质的精液；再试验室测定原精活力、密度。

2.不同稀释液对比。依照表1所示，配制不同卵黄浓度的稀释I液和不同甘油浓度的稀释II液，分别组合成1、2、3、4、5号稀释冷冻液。根据精液密度，用I液第一次稀释，4℃平衡2小时；用等量II液第二次稀释，再4℃平衡2小时；选取精子活力≥0.6的精液进行冷冻。熏蒸方法如上文所述；采用湿解冻法，从液氮中取出一支细管冻精在空气中晃动10秒，投入42℃水浴中并晃动20秒，擦干后进行活力检测。

3.不同熏蒸方式对比。经过稀释、平衡的精液，采取不同的熏蒸时间和距离液氮高度调节降温速率进行降温。方式一采取距离液氮4厘米，熏蒸7分钟；方式二采取距离液氮7厘米，熏蒸6分钟；方式三采取距离液氮7厘米，熏蒸7分钟；方式四采取距离液氮7厘米，熏蒸8分钟，随后将细管冻精投入液氮中。

三、结果与分析

1.对比分析中国美利奴（新疆型）细毛羊和德国美利奴细毛羊精液冷冻效果。中国美利奴（新疆型）细毛羊和德国美利奴细毛羊的原精活率、平衡后精子活率及冷冻解冻后活率差异均不显著（P＞0.05，表2）。

2.不同稀释液对中国美利奴（新疆型）细毛羊和德国美利奴细毛羊精液冷冻效果的分析。添加不同浓度卵黄液对中国美利奴（新疆型）细毛羊 精液冷冻解冻效果的影响，如表3所示，10%卵黄液添加组效果最好，且与15%和20%卵黄液添加组差异显著（P＜0.05），15%与20%卵黄液添加组间差异不显著（P＞0.05）。如表4所示，6%甘油添加组效果最好，且与7%和8%甘油添加组差异显著（P＜0.05），7%与8%甘油添加组间差 异不显著（P＞0.05）。

表1 冷冻稀释液配方

表2 两种细毛羊冻精活率分析

添加不同浓度卵黄液对德国美利奴细毛羊精液冷冻解冻效果的影响，如表5所示，10%卵黄液添加组效果较好，但卵黄液添加组间差异不显著（P＞0.05）。如表6所示，7%甘油添加组效果最好，且与8%甘油添加组差异极显著（P＜0.01），7%甘油添加组与6%甘油添加组差异不显著（P＞0.05）。

表3 添加不同浓度卵黄液对中国美利奴（新疆型）细毛羊冻精活率的影响

表4 添加不同浓度甘油对中国美利奴（新疆型）细毛羊冻精活率的影响

表5 添加不同浓度卵黄液对德国美利奴细毛羊冻精活率的影响

表6 添加不同浓度甘油对德国美利奴细毛羊冻精活率的影响

表7 不同熏蒸制作方式对中国美利奴（新疆型）细毛羊冻精活率的影响

表8 不同熏蒸制作方式对德国美利奴细毛羊冻精活率的影响

3.不同熏蒸制作方式对中国美利奴（新疆型）细毛羊和德国美利奴细毛羊精液冷冻效果的分析。不同熏蒸制作方式对中国美利奴（新疆型）细毛羊精子冷冻解冻后活率的影响，如表7所示，采取方式三距离液氮7厘米，熏蒸7分钟的效果最好，且与方式四距离液氮7厘米，熏蒸8分钟差异显著（P＜0.05），其他熏蒸制作方式差异不显著（P＞0.05）。

不同熏蒸制作方式德国美利奴细毛羊精子冷冻解冻后活率的影响，如表8所示，采取方式三距离液氮7厘米，熏蒸7分钟的效果最好，且与方式四距离液氮7厘米，熏蒸8分钟差异极显著（P＜0.01）；方式二距离液氮7厘米，熏蒸6分钟方式四距离液氮7厘米，熏蒸8分钟差异显著（P＜0.05）；其他熏蒸制作方式差异不显著（P＞0.05）。

四、讨论

卵黄作为营养物质的一种，能为精子的代谢提供能量，还能增强精子抗低温的能力。Cardoso等研究表明在哺乳动物精液稀释液中添10%～20%的卵黄效果最佳，与本次试验结果基本一致。

甘油作为广泛使用的精子冷冻保护剂，具有渗透性，在低温下使细胞脱更多的水，阻碍冰晶的形成，提高冷冻精子的成活率。但也具有一定的毒副作用，因此在不影响冷冻效果的基础上，需尽量降低甘油浓度。胡建宏等表明虽然添加7%和8%甘油浓度也有益于冻精活力，但添加6%的甘油效果最好。与本次试验结果基本一致。

精液冷冻结果易受个体以及稀释液成分等因素的影响，因此精液冷冻降温时间和降温速度也有所不同。本试验通过四种方式的对比，结果显示距离液氮7厘米，熏蒸7分钟的效果最好，最适用于本次试验羊冷冻解冻后精子活力的复苏。