乳酸乳球菌L19对乌鳢生长、免疫功能及抗氧化能力的影响

■孔祎頔 李 民 吴雪芹 尹 壮 单晓枫 王桂芹

（吉林农业大学动物科学技术学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林长春 130118）

乌鳢（Channa argus）属鲈形目、鳢科、鳢属，是一类有胃的肉食性鱼类，在我国分布范围广泛，是我国北方名特优鱼类，是国家“十三五”渔业规划重点发展鱼类，具有抗逆性强、营养丰富、经济价值高等诸多优点，得到了养殖者广泛喜爱。近年来，随着集约化养殖的发展，水体环境逐渐恶化，养殖者为了满足市场需求，错误地投喂高糖高脂饲料，又常常因储存方式不当导致饲料发生霉变及氧化酸败，将这样的饲料投喂给鱼类，直接影响了它们健康，引发各类鱼病，在乌鳢的养殖过程中最常见的疾病就是脂肪肝、肝胆综合征等。于是，养殖者开始大量使用化学药物或抗生素药物进行治疗，然而，抗生素的滥用不仅会导致水体药物残留，影响水产品安全及人类健康，阻碍乌鳢的绿色养殖，还会导致耐药菌株日益增多，破坏鱼类机体内微生态平衡。随着饲料无抗时代的到来，寻求有效的替抗添加剂尤为重要，当下具有潜力的包括中草药、植物提取物及益生菌等。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作为一类FAO公认的益生菌，是由发酵糖类产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏阳性菌，是水产动物肠道中的固有菌群之一，同时也是《饲料添加剂品种目录（2013）》中允许添加的菌种。LAB具有降脂、抑制有害菌、维持肠道菌群平衡以及增强机体免疫功能等诸多优点。因此，功能性LAB的筛选成为当下研究的热点之一，对研究水产动物的疾病有重要意义。目前，已从多种水产动物的肠道中筛选出了LAB，例如：尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、鲤（Cirrhinus mrigala）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等。本研究选取乌鳢为研究对象，探讨在饲料中添加从健康乌鳢肠道内容物中筛选出的乳酸乳球菌L19最适添加量对乌鳢生长和免疫功能的影响，为乌鳢的健康养殖及LAB在水产养殖业中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲料

乳酸乳球菌L19（GenBank: MT102745.1）从健康乌鳢肠道内容物中筛选获得并由本实验室保存；试验乌鳢购自山东临沂某养殖场，试验前暂养于塑料水族箱中，暂养期间投喂基础饲料，驯化14 d。基础饲料以鱼粉为蛋白源，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加0（对照组）、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/gL. lactisL19，配制成6种等氮等脂的试验饲料（见表2）。饲料原料经充分粉碎后、称重、混均、挤压成直径为1.5 mm的颗粒，将菌悬液均匀喷洒于基础饲料中制成L. lactisL19 终含量分别为1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109、1.0×1010CFU/g的饲料，基础饲料喷洒与菌悬液等体积的PBS溶液作为对照组饲料，在25 ℃空调房晾干，每3 d准备一批新的饲料，保存在4 ℃的单独密封的塑料容器中，以保持LAB的活性，每天检测制备的饲料中LAB活性。

表1 试验饲料配方及其营养水平（%干物质基础）

表2 试验设计

1.2 试验设计及饲养管理

暂养结束后，选取540 尾体质健康、大小一致的乌鳢，初始体质量为（8.68±0.22）g，随机分配到18 个塑料水族箱中，分成6 个处理组，每处理3 重复，每重复30尾鱼。每天09：00、16：00饱食投喂2次，饲养8周，温度（26±2）℃，pH（7.5±0.1），氨氮＜0.5 mg/L，亚硝酸盐＜0.05 mg/L，溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 样品收集

饲养8周，禁食24 h，计数并称重；每桶随机取10尾鱼，用100 mg/L MS-222 麻醉，尾静脉采血，4 ℃静置12 h，4 000 r/min离心15 min收集血清，-20 ℃保存待测。在冰上快速收集肝脏和肠道，在液氮中快速冷冻，-80 ℃保存待测。

1.4 生长指标测定

平均增重率（WG，%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生长率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

饲料效率（FER，%）=100×（Wt-W0）/I

蛋白质效率（PER）=（Wt-W0）/（I×C）

成活率（SR，%）=100×（试验末存活鱼总数/试验初存活鱼总数）

式中：I——摄入饲料的重量（g）；

t——试验时间（d）；

W0、Wt——试验初始和结束时乌鳢的体质量（g）；

C——饲料蛋白质的含量（%）。

1.5 免疫及抗氧化相关酶测定

血清中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性及免疫球蛋白M（IgM）、补体3（C3）、补体4（C4）含量，肝脏和肠道中总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量，均参考Liu 等和Guo 等的方法通过南京建成研究所试剂盒测定。

1.6 统计分析

采用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析，用Duncan’s多重比较法进行组间多重比较，数据用“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 L. lactis L19 对乌鳢生长和饲料利用的影响（见表3）

表3 乳酸乳球菌L19对乌鳢生长和饲料利用的影响

由表3可知，8周的饲养试验结束后，L. lactisL19添加量分别为1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 组乌鳢的终末体质量、增重率、特定生长率、饲料效率及蛋白质效率均显著高于对照组（P＜0.05），但上述的试验组间的差异不显著（P＞0.05）。其中，L. lactisL19添加量为1.0×108CFU/g 组达到最高。与对照组相比，L. lactisL19添加量为1.0×106CFU/g组的这些指标均无显著差异（P＞0.05）。

2.2 L. lactis L19对乌鳢免疫功能的影响（见图1）

由图1A、B可知，8周的饲养试验结束后，L. lactisL19 添加量分别为1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 组乌鳢血清中的IgM 和C4 含量均显著高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，L. lactisL19添加量分别为1.0×106CFU/g和1.0×107CFU/g组乌鳢血清中的IgM 和C4 含量有升高趋势，但差异不显著（P＞0.05）。由图1C、D、E 和F 可知，8 周的饲养试验结束后，除L. lactisL19 添加量为1.0×106CFU/g 组乌鳢血清中的ACP、AKP 和LZM 活性及C3 含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），其余各添加组均显著高于对照组（P＜0.05），其中，L. lactisL19添加量为1.0×108CFU/g组达到最高。

图1 乳酸乳球菌L19对乌鳢血清非特性免疫指标的影响

2.3 L. lactis L19对乌鳢抗氧化能力的影响（见图2）

由图2A 可知，8 周的饲养试验结束后，L. lactisL19添加量分别为1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g组乌鳢肝脏和肠道中的SOD活性均显著高于对照组（P＜0.05），其中，L. lactisL19 添加量为1.0×108CFU/g 组达到最高。由图2B 可知，L. lactisL19 添加量分别1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 组乌鳢肝脏中的CAT活性均显著高于对照组（P＜0.05）；L. lactisL19 添加量分别1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g组乌鳢肠道中的CAT活性显著高于对照组（P＜0.05）。由图2C 可知，在肝脏中，除L. lactisL19 添加量为1.0×106CFU/g 组乌鳢的GSH-Px 活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05），其余各添加组均显著高于对照组（P＜0.05）；在肠道中，1.0×106CFU/g 组和1.0×1010CFU/g 组的GSH-Px活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05），1.0×107、1.0×108CFU/g 组和1.0×109CFU/g 组显著高于对照组（P＜0.05）。相反地，由图2D 可知，所有添加L. lactisL19组乌鳢肝脏中的MDA含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中，L. lactisL19 添加量为1.0×108CFU/g 组达到最低，L. lactisL19 添加量为1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g 组有逐渐回升的趋势。在肠道中，除L. lactisL19 添加量为1.0×106CFU/g 组的乌鳢MDA含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），其余各添加组均显著低于对照组（P＜0.05）。

图2 乳酸乳球菌L19对乌鳢肝脏和肠道抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 L. lactis L19对乌鳢生长、饲料利用的影响

在饲料中适量添加L. lactis，可有效促进动物生长、饲料利用和蛋白质合成。研究报道，添加LAB 可以显著提高鲤（Cyprinus carpio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、真鲷（Pagrus major）、太平洋红鲷（Lutjanus peru）、罗非鱼（Oreochromis spp.）、驼背鲈（Cromileptes altivelis）等的生长性能。在本研究中，饲料中L. lactisL19 添加量分别为1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g 和1.0×1010CFU/g时，乌鳢FBW、WG、FER、SGR和PER均显著提高，比对照组和1.0×106CFU/g效果显著，说明饲料中添加适量浓度的L. lactisL19能有效提高饲料蛋白质利用率，从而促进乌鳢的生长。与我们的研究结果一致，饲料中L. lactisHNL12添加浓度为1.0×108CFU/g和1.0×1010CFU/g时比对照组和1.0×106CFU/g组效果显著，均能显著提高驼背鲈的FBW、WG 和SGR。同样，在饲料中添加1.0×108CFU/gL. lactis subsp. lactis JCM5805，饲喂给罗非鱼6 周后显著提高了FBW、WG和FER。以上结果均表明，饲料中添加适量的L. lactis能够提高鱼类的生长性能，但所添加的适宜浓度因鱼种类、大小以及L.lactis菌株的不同而不同。

3.2 L. lactis L19对乌鳢免疫功能的影响

LAB作为典型的益生菌之一，是水产动物肠道中固有的菌群之一，能够黏附在水产动物肠道表面，具有良好的抑制病原菌和增强机体免疫的能力。LAB可刺激造血功能，从而提高鱼类的体液免疫。IgM、C3、C4、ACP、AKP和LZM是体液免疫系统的主要组成成分，在体液免疫中起关键作用，是评价鱼类免疫功能的常见指标。在本研究中，饲料中L. lactisL19 添加量为1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g时，乌鳢血清中IgM 和C4 含量均显著升高，比对照组、1.0×106CFU/g 组和1.0×107CFU/g 组效果显著，当饲料中L. lactisL19添加量为1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/g和1.0×1010CFU/g时，乌鳢血清中的ACP、AKP和LZM活性及C3含量均显著升高，比对照组和1.0×106CFU/g组效果显著，且添加浓度为1.0×108CFU/g 组乌鳢表现出最好的免疫水平。与本研究结果相似，在饲料中添加1.0×107CFU/g 的德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii），饲喂黄河鲤8周后，ACP和LZM活性显著增加。同样，在饲料中添加1.0×106CFU/g沙克乳酸杆菌（Lactobacillus sakei），饲喂太平洋红鲷6 周后，IgM 含量和LZM 活性显著升高。此外，在饲料中添加1.0×1010CFU/g 的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）VSG3，饲喂南亚黑鲮60 d 后，IgM 含量及ACP 和LZM活性均显著升高。在硬骨鱼饲料中添加不同种属LAB 的适宜添加量可能略有不同，推测原因可能是LAB菌种、饲料配方及其他环境因素等条件的不同。

3.3 L. lactis L19对乌鳢抗氧化能力影响

通常SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 是检测水产动物抗氧化能力的重要指标。在本研究中，饲料中L.lactisL19 添加量分别为1.0×107、1.0×108CFU/g 和1.0×109CFU/g 时，乌鳢肝脏和肠道中SOD、GSH-Px及肝脏中的CAT 活性均显著升高，比对照组和1.0×106CFU/g 组效果显著，而MDA 则呈现相反的趋势。在黄河鲤的研究中观察到相似的结果，将添加1.0×107CFU/g德氏乳杆菌的饲料投喂黄河鲤8周后，肝脏中的SOD、CAT 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低。与本研究结果一致，将添加1.0×106CFU/g 沙克乳酸杆菌的饲料投喂太平洋红鲷6周后，显著增加了血清中的SOD和CAT活性。以上结果均表明，在饲料中添加适宜浓度的LAB 菌株可以有效清除鱼体内过多的自由基，增强鱼类的抗氧化能力。

当下，人们越来越重视水产品安全及水体环境等问题，细菌性疾病的暴发就成了困扰水产养殖人员的难题之一，而益生菌、抗菌肽及中草药制剂的研发成为了防控水产病害的新方法，能在一定程度上提高鱼体健康。本试验结果为乌鳢健康养殖以及深入探讨LAB对水产动物的益生作用奠定了理论基础。

4 结论

综上所述，饲料中适量添加L. lactisL19 在一定程度上可有效促进乌鳢生长、饲料利用，提高免疫功能和抗氧化能力。在本试验条件下，乌鳢饲料中L.lactisL19的适宜添加量为1.0×108CFU/g。