蒙脱石和酵母多糖对T-2 毒素的吸附效率研究

■杨建荣 赵佳玮 李 晶 李彦伸 高永林 卢国柱 尤艳莉*

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005；2.烟台绿叶动物保健品有限公司，山东烟台 264005）

随着我国经济水平和人们生活水平的不断提高，人们对营养丰富、蛋白质含量较高的禽畜肉的需求量正快速增加，禽畜养殖业的迅速发展不仅对饲料的需求量大大增加，更对饲料的品质有了更高的要求，饲料的品质会直接影响到养殖业的发展和人们的食品质量安全，因此保证饲料的质量安全是保障食品安全和人类健康的重要途径之一。目前饲料中普遍存在的霉菌毒素是饲料生产和使用过程中常见的问题。饲料中常见且危害较大的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2 毒素及伏马菌素等[1]。龚阿琼等[2]从市场上抽取的63 份样品皆检测出多种霉菌毒素。霉菌毒素被动物采食后可能导致动物生长受阻、繁殖机能下降、组织坏死、免疫抑制、癌变及基因突变等[3]。T-2 毒素是A 型单端孢霉烯族毒素中最强的毒素，主要存在于玉米、小麦、大麦和燕麦中。T-2 毒素主要作用于骨髓、肝脏等，可引起动物食欲下降或拒绝采食、体重降低、腹泻和反应迟钝等症状，还可造成脾脏出血等[4]。GB 13078-2017 规定了猪、禽配合饲料中T-2 毒素的限量为≤0.5 mg/kg。毒素的存在不仅会使饲料利用率大大降低，更严重的问题是毒素会残留在肉、蛋、奶等畜产品中，导致食用者霉菌毒素中毒，危害人类健康。因此毒素的存在对禽畜养殖业具有很严重的危害性，饲料中毒素的检测和脱毒已成为饲料研究的重要项目。天然矿物质蒙脱石（MMT）的主要成分是硅铝酸盐，能吸附霉菌毒素、重金属、细菌，在动物肠道中修复和保护消化道黏膜，防治腹泻[5]，是目前饲料中除霉除菌的主要添加成分。研究表明，硅铝酸盐在pH 6.5 条件下对黄曲霉毒素的吸附效果较好，吸附率能达到84.00%[6]。酵母多糖的主要成分为大分子的葡聚糖、甘露聚糖及糖蛋白复合物，已有研究表明酵母多糖对黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮都有较好的吸附脱毒能力[7]。蒙脱石+酯化葡甘露聚糖对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素的吸附率最高可达96%、95%和98%[8]。另外，动物试验证明由蒙脱石和葡甘露聚糖组成的复合吸附剂添加到饲料中不仅对动物机体没有伤害，而且能减少由于饲料霉变而引起的肝、肾等的肿胀，恢复机体的总蛋白含量和血清酶活性等的正常水平[9]。对T-2 毒素的吸附脱毒可以采用物理法、化学法和生物法等[10]。陈亚黎[11]进行苯甲酰胺衍生物和β-环糊精对T-2 毒素脱除效果的研究。Devegowda 从酵母菌细胞中分离出酯化葡甘露聚糖，进行了对T-2 毒素的脱毒效果研究。目前饲料脱毒研究较多的是蒙脱石对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的吸附脱毒，而蒙脱石和酵母多糖对T-2 毒素的吸附脱毒还少有研究[12]。本试验在蒙脱石和三种酵母多糖中分别添加T-2 毒素，经体外吸附试验，研究不同吸附剂对T-2 毒素的吸附效果。本试验根据T-2 毒素在208 nm 有紫外吸收的特点，采用高相液相色谱法测定T-2 毒素的含量，从而得出一定浓度范围内蒙脱石和酵母多糖对T-2毒素的吸附率和吸附量，以期对饲料中T-2 毒素的脱毒提供理论依据，为饲料生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

蒙脱石（含量95%）由烟台海润斯生物科技有限公司提供；酵母细胞壁、酵母β-葡聚糖G70、甘露糖蛋白由安琪酵母股份有限公司提供。

T-2毒素标准品（以色列Fermantteck公司）；乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸氢二钾和氢氧化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）配制成pH6.8的缓冲溶液；磷酸二氢钾和盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）配制成pH 3.0的缓冲溶液。

Agilent1100 高效液相色谱仪（配VWD 紫外检测器）；AL-204 分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；SHA-CA水浴恒温振荡器（北京市永光明医疗仪器有限公司）；TGL-16gR 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 T-2含量的HPLC检测方法

1.2.1.1 色谱条件

根据紫外扫描T-2 毒素在208 nm 处有吸收，因此本试验选择检测波长为208 nm；色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈+水=70+30；柱温：30 ℃；进样量10 μL；流速：1 mL/min。

1.2.1.2 T-2标准溶液的配制和标准曲线的制作

准确称取5 mg的标准品用乙腈稀释定容至5 mL，得到浓度为1 mg/mL的标准贮备液。移取100 μL标准贮备液用乙腈稀释定容至2 mL，得到浓度为50 μg/mL的标准中间液。准确移取20、40、80、120、200 μL 标准中间液用乙腈稀释定容至2 mL，得到浓度分别为0.5、1、2、3、5 μg/mL的标准使用液。根据标准使用液的浓度和峰面积作图得到标准曲线。根据保留时间定性，外标法定量。

1.2.2 吸附试验

1.2.2.1 蒙脱石对T-2毒素的等温吸附试验

准确称取5 份2 mg 蒙脱石至5 mL 具塞离心管中，分别加入100 μg/mL 的标准溶液20、30、40、50、60 μL，再加入pH 为6.8 的磷酸缓冲溶液使其最终体积为2 mL，于37 ℃恒温振荡吸附2 h，振荡速率为140 r/min，再于6 000 r/min 的离心机上离心5 min，上清液用0.45 μm膜过滤后用HPLC检测，同时做3次平行试验。根据标准曲线求出吸附后溶液的浓度，得到浓度的平均值，见式（1）、（2）求出蒙脱石的吸附量和吸附率。

式中：Q——吸附量（μg/mg）；

C0——吸附前T-2浓度（μg/mL）；

C——吸附后T-2浓度（μg/mL）；

V——溶液体积（mL）；

m——吸附剂质量（mg）；

Y——吸附率（%）。

1.2.2.2 不同吸附时间对三种酵母多糖吸附作用的影响

分别准确称取5 mg三种酵母多糖各4份，准确加入100 μg/mL T-2 标准溶液30 μL，再加入pH 6.8 的磷酸缓冲溶液使其最终体积为2 mL，涡旋混合均匀后，在37 ℃、140 r/min的条件下，分别振荡0、1、2、3 h后离心（6 000 r/min，5 min），0.45 μm 滤膜过滤。在上述色谱条件下测定，根据标准曲线和样品的峰面积得到吸附后T-2 的平均浓度并求出吸附量和吸附率。平行测定3次。

1.2.2.3 不同温度对三种酵母多糖吸附作用的影响

本试验研究了常温25 ℃和体温37 ℃下三种酵母多糖的吸附作用。分别准确称取5 mg三种酵母多糖各2 份，准确加入100 μg/mL T-2 标准溶液30 μL，再加入pH 6.8 的磷酸缓冲溶液使其最终体积为2 mL，在其他条件完全相同的情况下分别探究25、37 ℃下酵母多糖对T-2 毒素吸附脱毒效果的影响。平行测定3次。

1.2.2.4 不同pH值对三种酵母多糖吸附作用的影响

因为胃液pH在3左右，肠道pH在6.8左右，因此本试验采用pH 3.0 和pH 6.8 探讨pH 对吸附作用的影响。分别准确称取2 组5 mg 三种酵母多糖各6份，依次准确加入100 μg/mL 的标准溶液10、20、30、40、50、60 μL，第一组加入pH 6.8的磷酸缓冲溶液、第二组加入pH 3.0 的磷酸缓冲溶液并使最终体积皆为2 mL，涡旋混合均匀后，经振荡（37 ℃，140 r/min，2 h）、离心（6 000 r/min，5 min），上清液用0.45 μm 滤膜过滤。在上述色谱条件下测定，根据标准曲线和样品的峰面积得到吸附后T-2 的平均浓度并求出吸附量和吸附率。平行测定3次。

1.2.3 最低检出限、定量下限和精密度的测定

将T-2标准溶液逐步稀释后进样，当峰高为基线噪声的3 倍（约为0.06 mAU）时所对应的浓度即为仪器的最低检出限。

将T-2标准溶液逐步稀释后进样，当峰高为基线噪声的10 倍（约为0.2 mAU）时所对应的浓度即为定量下限。

将标准溶液连续进样6次，根据峰面积求出该仪器精密度。

本试验取得的数据采用方差分析中单因素方差法（one-way ANOVA）进行数据处理，利用显著性检验法进行分析判断。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作和标准曲线方程（见图1、图2）

图1 T-2毒素标准色谱

图2 T-2毒素标准曲线

将标准溶液在确定的色谱条件下进样，得到标准溶液色谱图，保留时间为3.9 min，色谱图见图1。

根据峰面积和标准溶液的浓度得到标准曲线和回归方程，标准曲线方程是y=4.749 2x+0.116 8，相关系数是R2=0.999 1，说明在该线性范围内线性关系良好。标准曲线如图2所示。

2.2 蒙脱石对T-2 毒素的吸附量和吸附率（见图3～图4）

图3 蒙脱石吸附毒素后的色谱峰

图4 蒙脱石对T-2的等温吸附曲线

将蒙脱石在试验条件下吸附T-2 毒素后的滤液进样，得到样液的色谱图如图3 所示，保留时间4.001 min的峰即为T-2的峰。

根据峰面积和标准曲线方程求得蒙脱石对T-2毒素的吸附量和吸附率，以平衡浓度为横坐标，吸附率为纵坐标，得到蒙脱石在pH 为6.8、37 ℃时的等温吸附曲线如图4 所示。由图4 得出，MMT 对T-2 的等温吸附曲线呈非线性相关。在本试验条件下蒙脱石的最大吸附量可以达到1.80 μg/mg，最大吸附率为87.10%。

2.3 吸附时间、温度、pH对三种酵母多糖吸附效果的影响

2.3.1 不同吸附时间对吸附效果的影响（见图5）

如图5 所示，随着吸附时间的增加，三种酵母多糖对T-2 毒素的吸附在2 h 达到饱和。在不同的吸附时间，酵母细胞壁的吸附率显著高于其他两种酵母多糖（P＜0.05）。其中酵母细胞壁在2 h 时的吸附率最大为45.60%，最大吸附量为0.56 μg/mg；其次是甘露糖蛋白，吸附率为33.60%，最大吸附量为0.14 μg/mg。由试验可看出，吸附时间对甘露糖蛋白作用更加明显，吸附量和吸附率随时间的改变变化较大。由于解吸作用使3 h 时的吸附量和吸附率有所下降。

图5 不同吸附时间三种酵母多糖吸附率对比

2.3.2 不同温度对吸附效果的影响（见图6）

图6 不同温度三种酵母多糖吸附率对比

如图6 所示，三种酵母多糖在37 ℃时的吸附率和吸附量都高于25 ℃时。三种酵母多糖都具有吸附效果，但效果差异并不显著。其中酵母细胞壁的吸附率最大为39.79%，吸附量为0.41 μg/mg；其次是甘露糖蛋白，最大吸附率为33.60%，吸附量为0.14 μg/mg。由图6 可看出，温度对酵母细胞壁和酵母β-葡聚糖作用更加明显，吸附率变化较大，对甘露糖蛋白的影响较小。分析其原因可能是甘露糖蛋白分子间存在氢键使其热稳定性更好，不易受外界温度影响。由试验可看出，温度会显著影响酵母多糖对T-2 的吸附能力，在体温37 ℃下更有利于发挥其生物活性，增强吸附效果。

2.3.3 不同pH对吸附效果的影响（见图7～图9）

如图7～图9 所示，pH 对三种酵母多糖吸附效果的影响都较大，且pH 3.0 时的吸附量明显大于pH 6.8 时的吸附量，说明酸性条件更有利于对T-2的吸附。酵母细胞壁和酵母β-葡聚糖都是随着T-2 毒素浓度的增加，吸附量先逐渐增加，且在T-2浓度为1.5 μg/mL 时其吸附量达到最大，当浓度再增加后吸附量反而会下降。

图7 不同pH下酵母细胞壁对T-2的吸附

图8 不同pH下酵母β-葡聚糖对T-2的吸附

图9 不同pH下甘露糖蛋白对T-2的吸附

2.4 蒙脱石和三种酵母多糖吸附结果综合分析（见图10）

由图10 可知，蒙脱石对T-2 的吸附作用远远高于三种酵母多糖，可以作为常规饲料添加剂吸附T-2毒素。三种酵母多糖中酵母细胞壁的吸附作用最好，其次是甘露糖蛋白。

图10 不同吸附剂吸附量对比

2.5 检出限、定量限和精密度的测定

将标准工作液稀释后制得一系列不同浓度的标准品溶液，按上述HPLC 色谱条件经0.45 μm 滤膜过滤后进样检测后知：检出限为0.08 μg/mL，定量限为0.25 μg/mL，说明仪器灵敏度高，能满足检测要求。

将标准品溶液连续进样6次，根据峰面积得到精密度为2.81%，符合仪器精密度要求。

3 讨论

霉菌毒素对禽畜养殖业造成的损失是非常严重的。本试验模拟动物体内环境（pH 6.8，37 ℃）对T-2 进行体外吸附，证明了蒙脱石对T-2 毒素有较高的吸附能力，在设定的试验条件下蒙脱石的最大吸附量可以达到1.80 μg/mg，最大吸附率为87.1%。蒙脱石的吸附主要为化学吸附，这种吸附要强于生物吸附。因此也决定了蒙脱石的吸附效果要优于酵母多糖。三种酵母多糖中酵母细胞壁对T-2 的吸附效果最好，吸附时间和pH 对酵母多糖的吸附效果影响较大。酵母细胞壁除富含β-葡聚糖和甘露聚糖（MOS）外，还含有多种生物活性物质，因此，三种酵母多糖中酵母细胞壁的吸附效果最优。已有研究结果表明，蒙脱石和酵母细胞壁的混合物能有效吸附饲料中的黄曲霉毒素（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEA）[7]，因此在未来吸附剂的发展可以侧重寻找有效的辅助成分。本研究的不足之处是只探讨了T-2 毒素的体外吸附试验，与受各种生理因素影响的复杂的动物体内的吸附可能存在一定的差异，还需进一步做动物试验进行研究。另外在此基础上可以继续研究在饲料中添加蒙脱石和酵母多糖的配比问题以达到最佳吸附效果。

4 结论

蒙脱石对T-2毒素有较大的吸附作用；三种酵母多糖中，酵母细胞壁的吸附量最大。因此，在饲料中添加一定量的蒙脱石和酵母细胞壁不仅可以吸附黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等毒素，还可以有效吸附T-2 毒素。添加了酵母多糖的饲料还可以利用其生物活性增强禽畜免疫力，有效减少禽畜患病率，利于养殖业发展，有效减少给人体带来的伤害。本试验虽然只是应用蒙脱石和酵母多糖对T-2 毒素进行了体外吸附研究，与吸附剂在动物体内的吸附还是有一定的区别，但可以为饲料生产企业使用蒙脱石和酵母多糖作为霉菌吸附剂提供依据。