醋 杆 菌 研 究 进 展 及 其 应 用 前 景

■陈霈瑶 郑 钢 童雨翠 刘梦瑶 程 强 张日俊*

（1.中国农业大学动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.中国农业大学动物遗传资源与分子育种实验室，北京 100193）

醋旧称醯、苦酒等，是烹饪中常用的液体酸味调味料。醋既能够去腥解腻还能增加菜肴的鲜味和香味，在食材加热过程中加入适量的醋，还能够减少维生素的损失，促使食材中的钙质分解，更易被人体吸收[1]。酿造醋以中国、日本、韩国为主的东亚地区主要采用多菌种固态发酵工艺，发酵过程中由于多种微生物共同代谢产生了大量的有机酸、氨基酸、挥发性风味物质等[2]，赋予固态酿造食醋丰富的口感，而欧美等大部分国家主要采用液态深层发酵工艺[3]。液态发酵食醋由于采用纯菌发酵，相较于固态发酵食醋，其风味物质比较单一。

食醋酿造中的产酸微生物种类繁多，发酵过程中的主要细菌为醋杆菌属（Acetobactersp.）、乳杆菌属（Lactobacillussp.）、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobactersp.）、葡萄球菌属（Staphylococcussp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、黄杆菌属（Flavobacteriumsp.）[4]，真菌为酵母菌属（Saceharomycetaceaesp.）和曲霉菌（Aspergillussp.）[5]。醋杆菌和乳杆菌是发酵过程中最主要的微生物。醋杆菌可在乙酸发酵阶段将大量的乙醇转化为乙酸，提高产酸量及出醋率，因此成为研究热点。国内外有关醋杆菌的研究主要集中于新型醋杆菌菌种的分离与选育[6]；以不同原料为底物的乙酸发酵工艺优化，包括新型果醋、粮醋等的开发等[7]；传统食醋酿造过程中菌群多样性分析以及醋杆菌耐酸机理的探索[4]等方面。

因此文章综述了醋杆菌的生物学特性，并阐述了醋杆菌独特的耐乙酸机制以及醋杆菌的应用，以期为筛选具有耐酸耐乙醇的益生菌，以及利用醋杆菌特殊机制和有益代谢产物在畜牧生产中发挥作用提供新的思路。

1 醋杆菌的生物学特性

1.1 醋杆菌的定义及分类

醋杆菌是α-变形菌纲（α-Proteobacteria）、红螺菌目（Rhodospirillales）中的一类革兰氏阴性的专性好氧型细菌，广泛分布于各种自然场所，包括发酵食品、腐败植物、腐败动物和土壤中，细胞呈杆状或者椭圆状，通常单个存在，也可成对成链，不形成芽孢，部分菌株能够产生色素和纤维素，分为运动型和非运动型，运动型有周生鞭毛或者极生鞭毛，醋杆菌包括醋杆菌属和葡糖杆菌属等。醋杆菌属种类繁多，加上未分类的醋杆菌有36 种被NCBI 收录，包括东方醋杆菌（Acetobacter orientalis）[8]、酿酒醋杆菌（Acetobacter cerevisiae）[9]、木瓜醋杆菌（Acetobacter papayae）[10]、米醋醋杆菌（Acetobacter oryzoeni）[11]、攀膜醋杆菌（Acetobacter ascendens）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）等，醋酸杆菌属能够将乙酸和乳酸代谢成CO2和H2O[12]。葡糖杆菌为周生鞭毛、可运动或无运动性的细菌种群，在乙醇、葡萄糖或醋酸盐作为碳源时生长最佳，如Ga.oboediens菌株能在含30%葡萄糖的培养基上生长，并积累高浓度的葡萄糖酸[13]，可超氧化乙醇为CO2和H2O，培养基中醋酸盐的浓度决定能否将醋酸盐转化为CO2和H2O。

1.2 醋杆菌的代谢途径

醋杆菌的主要代谢途径包括乙醇氧化呼吸、三羧酸循环（TCA）、丙酮酸代谢途径。其中醋杆菌代谢的最大特征是在有氧条件下能将乙醇氧化为乙酸[14]。醋杆菌具有氧化乙酸的能力，称为过氧化反应，主要是靠三羧酸循环和乙醛酸循环来完成。这种过氧化反应与乙醇、乙酸、氧气含量等有关。醋酸发酵过程首先通过醇脱氢酶（ADH）将乙醇氧化为乙醛，然后由醛脱氢酶（ALDH）将乙醛再氧化为乙酸，最终实现食醋酿造[15]。

1.3 醋杆菌的乙醇耐受性

醋杆菌生长过程中能够利用乙醇，因此在选择菌株时，需要考虑其乙醇耐受性。刘阳等[16]于2018年从保宁醋醋曲中筛选出4株醋杆菌，其在2%～9%的乙醇中均能生长，其中，菌株A11能够达到13%的乙醇耐受力。王超宇[17]从山西老陈醋中筛选的CP 175、CP 40、CP 416菌株对乙醇的耐受能力较好，可耐受的乙醇度值为10%。

然而乙醇浓度过高会抑制菌株的生长，大大降低乙醇的转化率和产酸的速率。有研究发现，使用5%(V/V)乙醇和3%(W/V)乙酸和菌株预培养后，约有87.3%的菌株呼吸链没有受到乙醇的损伤，但有41.6%的菌株其细胞膜的完整性受到了破坏[18]。利用基因芯片技术对醋杆菌三羧酸循环和乙醛酸循环等有关基因的表达水平进行测定，发现以乙醇为碳源时，与乙醛酸有关的基因和应急反应(SOS)有关基因表达上调，因此，乙醇可能引起菌体内蛋白质和DNA的氧化损伤[19]。

面对乙醇引起的损伤，微生物主要通过同源适应（Homeovicous Adaptation）机制和膜脂中脂肪酸的异构化来实现细胞对有机溶剂的抗性，微生物通过调整膜中脂肪酸的饱和度和脂酞基的长度来维持膜原有的流动性，在有机溶剂存在的情况下，微生物可非常迅速地改变顺式脂肪酸和反式脂肪酸的比例来对抗细胞膜通透性的增加[20]。

2 醋杆菌的耐酸机制

2.1 耐酸机制分子基础

以通过诱变获得的乙酸敏感突变株作为宿主，通过克隆获得具有乙酸抗性的DNA 片段，发现其中大小为8.3 kb的PstⅠ片段与乙酸抗性有关，其中AarA、AarB、AarC是乙酸抗性基因。1.6 kb 的SphⅠ片段存在AarA基因，它具有一个单独的开放阅读框区域，与大肠杆菌的柠檬酸合酶基因序列（Citrate Synthases，CSs）具有64.3%的相似性[21]，与铜绿假单胞菌的CSs具有67.8%的相似性[22]，且分子大小和AarA基因的产物相似，因此AarA基因可能编码CSs[23]。AarC能够编码含492 个氨基酸残基的蛋白质，与Neurospora crassa acu-8 基因具有44%的同源性，其编码的蛋白具有乙酸氧化的功能，是一种羧酸辅酶A转移酶[24]。

醋杆菌细胞破碎上清的双向凝胶电泳分析表明，上清部分存在几种蛋白质，它们的产量对乙酸的产生有不同程度的促进作用，其中一种表观分子量为100 ku 的蛋白质在乙酸作用下显著增加，经—NH2末端氨基酸序列测定和随后的基因克隆鉴定为乌头酸酶[25]，过表达乌头酸酶基因，可以提高酶的活性和菌体的抗乙酸能力，并且可以缩短发酵周期。

2.2 耐酸调节通路

2.2.1 质子动力外排泵（见图1）

图1 乙酸吸收示意图[26]

因为醋杆菌优异的耐酸特性，学者们推测在细胞质膜上可能存在一个外排泵，能够将乙酸从细胞质中外排出细胞质膜，但是早期通过蛋白质组学方法研究的醋杆菌与乙酸适应性相关的50 多种蛋白质中，没有发现某种蛋白质是期待的外排蛋白，通过ISO（Inside-out）膜囊模型模拟醋杆菌质子动力外排泵，发现醋杆菌能通过呼吸作用产生质子动力，ISO 膜囊内部为阳性和酸性（见图1a）。在完整的细胞中，呼吸作用通过ADH 和、乙醛脱氢酶（ALDH）将乙醇氧化为乙酸，同时给氧化酶（terminal ubiquinol oxidase）提供电子，乙酸被外排泵被动穿过细胞膜排出（见图1b）。

2.2.2 柠檬酸循环（见图2）

图2 醋杆菌柠檬酸循环[乙酸激酶（AckA）、磷酸转乙酰酶（Pta）、乙酰辅酶A合成酶（Acs）]

有研究发现，醋杆菌含有完整但是非传统意义上的柠檬酸循环，其中乙酸抗性蛋白（AarC）将琥珀酰辅酶A 和乙酸酯转化为琥珀酸辅酶A 和乙酰辅酶A（见图2）[27]，促进了乙酸的代谢活化和氧化，醋杆菌柠檬酸循环（CAC）将乙酸盐转化为CO2，这是醋杆菌菌株特有的能力，乙酸乙酯到乙酰辅酶A的有效转化是必要条件，这可以通过AckA/Pta 或Acs 来执行，乙酸酯氧化过程中上述三种酶活性均增强[28]。

3 醋杆菌的应用

3.1 醋杆菌工业应用

核黄素被大量用作食品和饲料添加剂、食品着色剂和药物制剂，这种维生素的商业化生产可以通过化学合成或生物合成来完成。通过对一株葡糖醋杆菌FBFS97的全基因组测序[29]，结果表明该菌株具有核黄素产生的完整操纵子，通过响应面优化法和中心组设计优化了该菌株的培养基组分，核黄素产量达到23.24 mg/L，因此，其他醋杆菌可能也具有生产核黄素的潜能。

纤维素是地球上含量最丰富的生物聚合物，被认为是植物生物量的主要组成部分，也是细菌胞外聚合物的代表，植物纤维具有木质素、果胶、半纤维素和植酸等，导致回收困难且价格昂贵[30]，细菌合成纤维素提供了一种更具成本效益的供应方式。细菌纤维素形成独特的织态结构, 并因“纳米效应”而具有高吸水性和高保水性、对液体和气体的高透过率、高湿态强度，尤其在湿态下可原位加工成型等特性，可以应用于医疗业、食品行业、造纸业等。研究发现，番茄汁是鉴定巴氏醋杆菌生产细菌纤维素的有效培养基[31]，对10 L生产培养基的放大工艺进行了优化，细菌纤维素的最高产量达到7.8 g/L，并且纯度较高，木醋杆菌TISTR 967也被用于细菌纤维素的生产[32]，对醋杆菌V6生产细菌纤维素的培养基成分进行研究，显示甘油可以成为醋杆菌属细菌生产细菌纤维素的低成本底物[33]。

D-葡萄糖酸是一种无腐蚀性、不挥发、无毒、温和的有机酸，是水果、植物、葡萄酒和蜂蜜的天然成分，具有清新的酸味。它被欧盟食品安全局（EFSA）列为公认的食品添加剂(E574)，并被美国食品药品监督管理局（FDA）列为GRAS（公认为安全）添加，D-葡萄糖酸可以通过化学方法或纯化酶通过酶法生产，最常见的合成方法是氧化发酵。在醋杆菌中，D-葡萄糖酸可以通过两条不同的途径合成。用醋杆菌发酵草莓浓缩液中的D-果糖，可以实现D-葡萄糖向D-葡萄糖酸的选择性转化[34]。

3.2 醋杆菌畜牧生产应用

在畜牧方面，醋杆菌常和芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌等混合制备成为混合制剂。在蛋鸡产蛋后期的全价料中添加适量复合生物菌，可提高产蛋率及平均蛋重[35]，初生仔猪补给复合生物菌，可帮助仔猪迅速建立完善的肠道正常菌群，提高机体免疫力，维护仔猪自然健康状态[36]。葡糖醋杆菌重氮营养菌是革兰氏阴性菌、耐酸专性需氧菌具有固氮能力，对于农作物氮的利用有着举足轻重的作用，研究表明[37]葡糖醋杆菌对所施的氮肥具有固氮效果并且能够提高玉米的产量和品质。因此，在饲料原料的种植过程中利用醋杆菌的固氮作用能够有效提高饲料经济效益，减少成本。

4 结论

醋杆菌都是产生食醋的主要菌种，从第一株醋杆菌被发现以来，筛选获得的醋杆菌数量急剧增加，种属得到极大扩展，其生物学功能也越来越丰富，其特殊的耐酸机制受到了学者们的关注，近年来相关研究主要集中在耐酸机制相关的基因、通路等方面，并通过诱变等方法获得能够耐高浓度酸的新型菌株。在醋杆菌的全基因组分析中，也发现具有应用前景的代谢通路（如核黄素、细菌纤维素的产生）。醋杆菌产生的代谢产物推测可以调节肠道菌群，此外，因乙酸制品具有杀灭病原微生物的作用，因此筛选耐酸产乙酸的醋杆菌，其在畜牧生产中的消杀作用和益生作用也是一个极具潜力的研究方向。