一例山羊链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染的调查分析

潘 艳，贺会利，冯世文，李 军，袁翠平

（1.广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001；2.广西农业职业技术大学，南宁 530001）

链球菌（Streptococcus）是双球形有荚膜的革兰氏阳性球菌，广泛分布在自然界中，具有较强的致病性和传染性，多种动物易感，如猪、牛、羊、禽等，同时也是一种人兽共患传染病［1］。羊链球菌病是由C 群溶血性链球菌引起的，羊只感染后可以引起败血症、肺炎及乳房炎。如果防控不及时会给养殖业造成重大的经济损失，还可能引起严重的公共卫生问题。近年来羊链球菌的发生率呈逐年上升趋势［2］，需引起重视。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）为革兰氏阴性染色的细小球杆状菌，根据荚膜抗原的不同将多杀性巴氏杆菌分为A、B、D、E、F 5 个血清型。不同的血清型特异感染宿主，感染山羊的血清型多为A 型和B 型［3］。多杀性巴氏杆菌可使多种动物易感，在家畜和野生动物中感染较为普遍［4］，不同种的动物间会相互传染，人也可以被感染，羊感染后可出现呼吸道疾病和败血症，严重时可致死，需要及时采取措施，避免大规模的蔓延流行。通过对2020 年8 月，广西某养殖户送检1 份羊病料，进行细菌学和分子生物学检测，最终确定该病例是由链球菌与多杀性巴氏杆菌混合感染引起的，具体的诊断方法和报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病样来源 广西南宁市某羊场病羊突然死于圈舍内，死后鼻孔出血。病程持续略长的病羊，精神沉郁，体温升高到40.5 ℃，持久不退，呼吸急促，食欲减退或停食，有混杂血液的泡沫流出，死亡后腐败较快。对病死羊剖检可见，肺脏坏死严重，胃肠粘膜呈现出血性炎症变化，脾脏、肾脏有大量出血点，肝脏肿大，质地脆弱，肠系膜淋巴结肿大，小肠系膜出血严重，其他部位未见明显异常。

1.1.2 实验动物 昆明雄性小鼠10只，体重（20±2）g，购自广西医科大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂与仪器 病毒DNA/RNA 提取试剂盒、2×TaqMasterMix、DL 2000 DNA Marker（北京康为世纪生物科技有限公司）；琼脂糖凝胶（西班牙GENE公司）；血平板培养基（郑州安图生物工程股份有限公司）；营养琼脂（北京陆桥技术有限责任公司）；微量生化反应管、药敏纸片（杭州滨和微生物试剂有限公司）；PCR 仪、凝胶成像系统（Bio-rad 公司）；恒温培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养与鉴定 无菌条件下，采集病羊的肺脏、脾脏、小肠和淋巴结等组织样品液，划线接种于血琼脂培养基平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，对培养后的细菌进行革兰氏染色镜检，挑取单个菌落，划线接种于血琼脂培养基上，并对细菌进行形态学观察及生理生化鉴定。

1.2.2 16S rDNA 测序鉴定 将纯化的菌株经PCR扩增16S rDNA 序列后送至苏州金唯智生物有限公司进行测序。

1.2.3 药敏试验 采用NCCLS［5］推荐的K-B 纸片法，在无菌条件下，取100 μL 纯化后培养的菌液均匀涂于普通琼脂培养基上，选取青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等10 类共18 种常用抗菌药物贴在培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h 后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（Ф），判断其耐药性情况。

1.2.4 小鼠致病性试验 选取健康昆明小鼠10 只，随机分为试验组和对照组，每组各5 只。将分离菌培养物按0.2 mL（浓度为109CFU/mL）接种于试验组小鼠腹腔内，对照组注射等量的生理盐水，观察并记录小鼠的发病死亡情况。

1.2.5 引物设计与合成 参考文献［6］至文献［9］，将绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、肺炎克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌、溶血曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的引物序列交由北京英俊生物工程公司合成（引物信息见表1）。

1.2.6 PCR 检测 无菌采集适量羊的肺脏、脾脏、小肠和淋巴结等病料组织样品研磨均匀，加入1.5 mL 灭菌生理盐水，-20 ℃下反复冻融3 次，8 000 r/min离心10 min，取上清液，按照病毒DNA/RNA 提取试剂盒的说明书进行抽提。以此DNA 为模板，分别以绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、肺炎克雷伯氏菌、化脓隐秘杆菌、溶血曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌引物对病料进行PCR 扩增。PCR 反应体系为：2×EsTaqMasterMix 13 μL，上游引物、下游引物各1 μL（引物浓度25 pmol/μL），DNA 模板3 μL，ddH2O 7 μL，总反应体系为25 μL。瞬时离心混匀，PCR 反应程序为95 ℃5 min；95 ℃1 min，退火1 min（退火温度见表1），72 ℃1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息

2 结果与分析

2.1 形态特征及染色结果

经革兰氏染色后镜检，可看到革兰氏阳性球状菌。挑取单个菌落接种于血琼脂培养基平板上，结果在血琼脂培养基上形成灰白色、中间隆起、边缘呈锯齿状菌落，周围有明显的溶血区。

2.2 生化试验结果

将已纯化的革兰氏阳性球状菌接种于微量生化鉴定管中，37 ℃恒温条件培养24 h，进行生化试验。结果发现此病原菌可以发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、覃糖，MR 试验阴性，VP 试验阴性，不能发酵山梨醇、棉子糖、甘露醇、菊糖，具有链球菌的生化特性，初步判断为链球菌。

2.3 16S rDNA 测序

测序结果经NCBI 比对，与公布的链球菌（登录号：LC316906.1）同源性为98.99%，进一步证实分离的菌株为链球菌。

2.4 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离到的链球菌对青霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、土霉素、头孢噻呋钠高度敏感，对壮观霉素、阿莫西林中度敏感，对链霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、阿奇霉素等不敏感（表2）。

表2 药敏试验结果

2.5 小鼠致病性试验

试验组小鼠在接种6 h 后出现精神萎靡，18 h 后陆续死亡，最终死亡3 只，表明该菌有较强的致病性。解剖死亡小鼠，可见心包积液，心脏有出血点，肺出血，肝肿大并有坏死点。按照细菌学的方法进行鉴定为链球菌感染。对照组小鼠精神状态良好，无死亡，解剖未见病理变化。

2.6 PCR 扩增结果

用PCR的方法对病料样品进行检测，结果扩增出多杀性巴氏杆菌，未扩增出化脓隐秘杆菌、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、溶血性曼氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌，说明病料中检测到多杀性巴氏杆菌（图1）。

图1 病料样品的PCR 电泳结果

3 小结与讨论

本次病例经细菌学检测初步鉴定为链球菌感染，通过16S rDNA 测序确定该分离菌为链球菌，PCR 方法检测为多杀性巴氏杆菌，临床上疾病混合感染的概率逐渐增加，PCR 检测技术具有灵敏度高、特异性强特点，临床诊断需借助此技术同时进行检测，以免发生漏检。通过药敏试验结果显示，分离的链球菌对青霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、土霉素、头孢噻呋钠高度敏感，可以作为治疗羊链球菌病的首选药物，不建议使用链霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、阿奇霉素等，合理用药，防止滥用抗生素，导致耐药性增加。致病性试验结果显示该菌具有较强的致病性，养殖场应该高度重视，应及时隔离并治疗发病羊，对病死羊采取无害化处理，防止病原蔓延。用10%石灰乳或0.5%漂白粉彻底地消毒污染的圈舍、场地和饲具等，全群接种羊链球菌氢氧化铝甲醛疫苗。对发病羊使用长效土霉素、头孢噻呋钠药物治疗，同时给予强心、补液，提高免疫力和抗应激能力。

羊链球菌一般通过呼吸道传播，为外源性传染病，带菌羊和病羊是该病的主要传染源，该菌具有较强的传染性，传播速度也较快、传染范围很广，不同年龄和品种的羊均可感染，且血清型较多，不同血清型之间的交叉保护能力低，如果采用单一的疫苗防控，很难达到有效的防控效果。目前还没有有效根治羊链球菌病的方法［2］，在进行诊断性治疗中，一定要明确具体的致病原因，根据药敏试验结果科学合理地使用抗菌药物，避免盲目使用抗生素，确保治疗的针对性和效果［9］。

多杀性巴氏杆菌属于条件致病菌，临床上较为常见，其血清型与致病性存在密切的关联［10］，不同血清型感染的宿主也不相同，研究表明，感染山羊的多杀性巴氏杆菌有A 型、B 型和D 型［11，12］。目前，中国对多杀性巴氏杆菌的血清型研究较少。但不同的血清型之间交叉保护性较低［13］，首先确定多杀性巴氏杆菌的血清型对该病的防控尤为重要。本研究通过PCR 检测方法，确定该病例为D 型多杀性巴氏杆菌，由于多杀性巴氏杆菌具有广泛的耐药性，给预防与治疗羊巴氏杆菌病带来一定的困难［14］。疫苗接种仍是防控多杀性巴氏杆菌的重要措施之一。

在日常养殖中，坚持自繁自养、全进全出的养殖模式。严禁从疫区引种，在引种前一定要进行严格的流行病学调查，保证引种的安全性、科学性、合理性。对发生过该类疾病的养殖场，在进入冬季前，应对全群进行疫苗接种，同时保证羊舍清洁卫生，日常养殖中应保证饲料营养价值均衡，增强羊只的抵抗力。