耐重金属肠杆菌GL-2 鉴定及对小麦促生作用的研究

蔡高磊，周 炀，赵昌松，彭宣和，张 振，赵建宁

（1.农业农村部农产品质量安全环境因子控制重点实验室，天津 300191；2.丹江口库区十堰生态农业研究院，湖北 十堰 442000；3.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191）

近年来，土壤重金属污染对生态系统和人类健康都构成严重威胁，日益成为严重的全球性环境问题。工业生产、采矿活动、农业生产中肥料和农药的使用、废水灌溉和废弃物的不当处理等人类活动都与土壤中的重金属污染有关［1-4］。重金属是土壤中的常见污染物，也是植物和动物代谢过程中的非必需元素，特别是土壤污染中的镉（Cd）被认为是重金属中最具毒性的污染物之一，因此它具有高迁移率和低允许暴露限值［5，6］。传统的重金属处理方法如土壤冲刷、稳定剂、酸淋洗、离子交换或电化学处理对土壤修复来说既昂贵效率又低，并且往往对土壤生态系统造成负面影响［7，8］。除了重金属毒性外，植物的生长还可能受到干旱、盐碱化和养分缺乏等不良环境胁迫，克服环境压力并促进植物生长对植物发挥自身性能必不可少。植物根系周围存在大量植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），它们是一群可以产生与植物生长相关物质，例如嗜铁素、吲哚3-乙酸（IAA）和1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）等来提高植物对重金属毒性的耐受性和促进植物生物量的有益根际细菌［9-11］。研究报道，与植物相关的PGPR 通过降低土壤中的重金属生物利用度来帮助植物生长和提高植物对重金属的耐受性，并减少重金属的吸收或转移到植物的上半部分［12-15］。Madhaiyan 等［16］报道，接种内生细菌Magnaporthe oryzae和Burkholderiaspp.可以增加植株生长，减少番茄根和芽中Ni 和Cd的积累，同样也减少了土壤中Ni 和Cd的有效性，是PGPR 菌株对重金属的吸附和生物积累的结果。此外，细菌还可以直接与重金属等污染物相互作用，以降低其毒性或调节其生物利用率［17］。因此，PGPR的应用是减少土壤中重金属积累和植物生长效率的有效途径。

本研究通过从土壤中分离一种PGPR 菌株，离体条件下筛选出具有耐重金属和嗜铁素活性，测定了该菌株对重金属的最低抑制浓度，并研究了其对小麦幼苗生长性状的影响，为该菌株在土壤中保护作物生长及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验土壤取自湖北省十堰市一处小麦种植地，取样时小心将小麦拔出并收集小麦根际的土壤置于无菌袋中，注明采样时间和地点，置于冰箱4 ℃保存备用。

LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，定容至1 000 mL，pH 为7.0，121 ℃灭菌20 min。

嗜铁素培养基［18］：CAS（铬天青）60.5 g，10 mL 三价铁溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O），HDTMA（十六烷基三甲基溴化胺）72.9 g，琼脂18 g，定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，定容至1 000 mL，pH为7.0，121 ℃灭菌20 min。

Murashige 和Skoog（MS）培养基［19］。

小麦品种：鄂麦DH16，为本实验室保存品种。

1.2 试验方法

1.2.1 耐CdCl2的PGPR 菌株的筛选 为了获得耐重金属细菌，称量10 g 根际土壤放入90 mL 无菌水中，摇床于28 ℃下180 r/min 振荡30 min，用稀释平板法连续将土壤混悬液稀释成10-1～10-3g/mL，并加入含有20 mg/L CdCl2的LB 培养基中涂抹均匀，放置在恒温培养箱中25 ℃下培养5 d。将生长出来的菌落接入LB 液体培养基中，25 ℃振荡培养48 h，用离心机5 000 r/min 离心10 min，收集菌体，再用无菌水稀释菌液浓度至1×107cfu/mL 接入嗜铁素培养基中，28 ℃下恒温培养5 d。观察菌落周围是否产生黄色晕圈，有黄色晕圈的是产生嗜铁素的PGPR 菌株。根据下列公式计算嗜铁素PGPR 菌株活性。

菌株活性=［（晕圈直径-菌落直径）/晕圈直径］×100%

1.2.2 重金属最低抑制浓度测定 为了检测分离菌株对重金属的抗性水平，选取生长最快、抗重金属最强、嗜铁素活性最高的PGPR 菌株，测定了PGPR 菌株对硫酸铜、硫酸锌、硝酸铅和氯化镉的最低抑制浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。采用平板稀释法在LB 培养基上添加Cu、Zn、Pb 和Cd 不同浓度的重金属，以菌株不能生长的最低重金属浓度为试验统计的生长临界值，每个处理3 次重复。

1.2.3 PGPR 菌株的分子鉴定和生理生化特征 对筛选出的PGPR 菌株送北京擎科新业生物技术有限公 司进行16S rDNA 和gyrB 分 子鉴定，16S rDNA 引物 为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。16S rDNA PCR 扩增条件为：94 ℃3 min；94 ℃45 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃停止。gyrB 引物为5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′，gyrB PCR扩增条件为：96 ℃5 min，96 ℃1 min，62 ℃1 min，72 ℃ 2 min，35 个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃停止。利用BLASTN 将获得的序列与GenBank 数据库中的16S rDNA 和gyrB 核苷酸序列进行比较。使用MEGA5.0 软件进行多序列比对并构建系统进化树。

1.2.4 PGPR 对重金属处理下植物生长的影响 挑取PGPR 菌株单菌落放入LB 液体培养基中，28 ℃振荡培养72 h，用离心机5 000 r/min 离心10 min，收集菌体，再用无菌水稀释菌液浓度至1×108cfu/mL 备用。将鄂麦DH16 种子用75%乙醇消毒8 min，再用无菌水清洗3 遍，然后用无菌滤纸吸干种子表面水分，分别放入MS、MS+PGPR、MS+PGPR+Pb、MS+Pb、MS+PGPR+Cd 和MS+Cd 培养基内，Pb 和Cd的终浓度均为50 mg/L，用0.22 μm 过滤器过滤灭菌后加入MS 培养基中混匀，每瓶5 粒种子，每个处理3 次重复，5 d 后调查各处理下小麦生长情况。

1.2.5 PGPR 对植物的促生长作用 选取健康的小麦种子，先用1.2% NaOCl 溶液消毒5 min，然后用75%乙醇消毒5 min，再用无菌水清洗3 次，最后将小麦种子放入无菌滤纸的培养皿中，加入适量无菌水，25 ℃恒温培养5 d 进行催芽，选取发芽一致的幼苗备用。每个花盆（直径15 cm）装有1.5 kg 土壤。试验设计，处理1：未添加PGPR 菌株的对照土；处理2：PGPR 活菌（1×108cfu/mL）接种土壤；处理3：PGPR活菌（1×105cfu/mL）接种土壤。每盆播种3 株幼苗，每个处理重复3 次，于分蘖期调查各处理下小麦的生长状况。

2 结果与分析

2.1 PGPR 菌株耐重金属和嗜铁素活性

5 株PGPR 在培养基上出现时间和嗜铁素活性不同（表1），GL-1 到GL-5 出现时间分别为25、20、29、49、46 h，说明在LB 培养基上加了重金属对PGPR 菌株生长有一定的抑制作用，5 株PGPR 嗜铁素活性从31.55%到65.88%，其中GL-2 活性最高，为65.88%。因此，GL-2是筛选的最合适PGPR菌株。

表1 耐CdCl2的PGPR 菌株的生长时间和嗜铁素活性

2.2 GL-2菌株对4种重金属的最低抑制浓度（MIC）

平板试验中（图1），重金属硫酸铜、硫酸锌、硝酸铅和氯化镉对GL-2 菌株表现出不同程度的抑制作用，GL-2 对添加Cu、Zn、Pb 和Cd的LB 培养基上的最低抑制浓度（MIC）分别为200、150、650 和200 mg/L，说明GL-2 菌株对重金属离子具有很强的耐受性，特别是对Pb的MIC 达650 mg/L。

图1 GL-2 对重金属的最低抑制浓度

2.3 GL-2 鉴定结果

利用16S rDNA 和gyrB 基因片段进行测序，分别得到长为1 426 bp 和742 bp的核苷酸序列。系统进化树表明（图2 和图3），GL-2 菌株和Enterobacterludwigii聚为一枝，与其他肠杆菌序列的相似性均低于Enterobacter ludwigii。此外，根据第九版Bergeys细菌鉴定手册，GL-2 菌株的生理生化鉴定结果（表2）与Enterobacter ludwigii基本一致。因此，GL-2菌株为Enterobacter ludwigii，命名为Enterobacter ludwigiiGL-2。

图2 GL-2 基于16S rDNA 序列构建的系统进化树

图3 GL-2 基于gyrB 序列构建的系统进化树

表2 GL-2 菌株的生理生化特征

2.4 GL-2 对重金属处理下小麦生长的影响

小麦生长情况（图4）表明，MS+PGPR 处理与MS+PGPR+Pb 处理的根长差异不显著；但与添加Cd处理相比，株高、根长及鲜重差异均达显著水平，说明重金属影响了小麦的生长，加入Enterobacter ludwigiiGL-2 对小麦生长具有一定的促进作用，可以减轻重金属对小麦生长的影响，特别是促进了小麦根长和增加了生物量。

图4 小麦生长情况

2.5 GL-2 对盆栽小麦生长的作用

盆栽试验结果（表3）表明，3种不同处理下，小麦的株高、根长和主根数没有明显差异。然而PGPR活菌（1×108cfu/mL 和1×105cfu/mL）接种小麦后，小麦根鲜重、分蘖数和根干重与对照相比具有显著差异。处理2 小麦根鲜重、分蘖数和根干重分别比对照增加了102.80%、93.17%和216.67%。处理3小麦根鲜重、分蘖数和根干重分别比对照增加了27.97%、55.28%和53.33%。PGPR 活菌在1×108cfu/mL 浓度下对小麦生长具有较强的促生效果。

表3 GL-2 对小麦的生长作用

3 讨论

肠杆菌在自然界中广泛存在，PGPR 对土壤修复已被证明是促进植物生长和保护植物免受重金属毒性的一种经济有效的方法［20，21］。此外，与植物相关的PGPR 细菌可能会使土壤中的重金属产生生物球或沉淀，并通过与阴离子官能团结合而降低重金属对生物利用率的毒性，还可以利用细胞外聚合物（多糖、蛋白质、腐殖质等）或细菌产生的铁载体、有机酸螯合金属离子以及荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescensACC9、P.fluorescensACC 23、Enterobactersp.NBRI K28 SD1 和Enterobacter ludwigiiNCR3的生理机制来促进植物生长和对重金属的吸附［1，3，22］。

本研究中，GL-2 属于Enterobacter ludwigii，具有生长速度快、嗜铁素活性强的特性，在重金属MIC 试验中，GL-2 对4 种不同重金属具有一定的耐受性，尤其是在含有Pb的培养基中MIC 高达650 mg/L，在含有50 mg/L 重金属Pb的MS 培养基中接种GL-2 菌株，小麦的根长和鲜重的生物量与对照无显著性差异，说明GL-2 菌株改善了重金属下小麦的生长环境，提高了小麦的生物量，减少了重金属对小麦生长的影响。盆栽小麦生长研究表明，Enterobacter ludwigiiGL-2 在1×108cfu/mL 浓度下，小麦根鲜重、分蘖数和根干重与对照相比具有显著差异，分别比对照增加了102.80%、93.17%和216.67%，对小麦的生长发育起到促生作用，这种明显的促生作用还有可能与其筛自小麦根际土壤有关。

综上，本试验对筛选、鉴定的PGPR 菌株、抗重金属能力及其对小麦施用效果的研究结果表明，PGPR 菌 株Enterobacter ludwigiiGL-2对减轻重金属影响和小麦生长具有积极的促进作用，对于制作微生物菌肥具有潜在的应用价值。另外，植物生长也受菌株、植物特性和土壤环境等因素影响，这些都需要进一步的研究来证实。