光照对黑青稞萌发过程中褪黑素、酚类物质含量和抗氧化活性的影响

朱雪洋，孟 想，徐宁莉，陶 谨，张莉方，张国强1，

(1.西藏自治区农牧科学院，西藏拉萨 850000； 2.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽芜湖 241000; 3.黄山王光熙松萝茶业股份公司，安徽黄山 242700)

褪黑素(melatonin)是一种备受关注的吲哚类小分子色胺，对人体具有多种调节功能[1]。如，改善睡眠、治疗抑郁和减缓衰老等[2]。在饮食中加入富含褪黑素的植物性食物，可以增加血液中褪黑素含量，改善人体健康，在美国和欧洲等国家已经把褪黑素作为食品补充剂，用来抵消松果体生理活性减弱的影响[3]。从褪黑素的发现到如今，虽然在茶和草药的浸液[4]、水果[5]、坚果[6]、烘焙食品[7]和发酵食品[8]中都发现了其存在，但关于谷物褪黑素的研究并不是很多。

青稞是人类饮食中重要的谷物之一，含有丰富的营养物质，如膳食纤维、γ-氨基丁酸、β-葡聚糖、微量元素、黄酮和酚酸等生物活性物质[9]。近年来，科学研究发现，黑色食品具有抗氧化、抗衰老、抗动脉硬化和保护心血管等功效，因此受到了消费者的喜爱；黑青稞是一种珍贵的药食两用的原材料，具有很大的潜在开发价值[10]。

在食品加工领域中，萌发处理是用来改善种子品质的一种重要措施。种子萌发期间会发生蛋白质及脂肪的水解和大分子物质合成等一系列生理生化变化，改变种子的风味和口感[11]。适当的萌发处理不仅能减少粮谷类种子抗营养成分，还能增加游离氨基酸、膳食纤维的含量，从而提高自身的功能性，特别是能富集一些对人体有益的生理活性物质，如在葵花籽中未检测到褪黑素，但萌发6 d后，葵花芽中褪黑素含量达到1.53 ng·g-1[12]；Saleh等[13]研究表明，不同品种豆类萌发过程中，子叶、胚根和种皮中褪黑素和酚类化合物的含量均随萌发天数增加而增加。也有学者发现，萌发3 d的青稞中，总酚和总黄酮含量分别达到2.96 mg·g-1和2.34 mg·g-1，是萌发前的1.85和2.02倍[14]；Tang等[15]也发现，萌发增加了不同粒色青稞总酚和总黄酮含量。光是影响种子萌发及其活性物质积累的重要因素。张玉梅等[16]发现，避光萌发苦荞的胚芽和胚根长度都优于有光照培育的芽苗；日光照射下油菜籽芽苗的总酚含量为0.29 mg·g-1，黄、绿、红、蓝和避光萌发时其总酚含量为0.96 ～ 9.49 mg·g-1[17]；光照可诱导苦荞芽苗中花青素和黄酮的积累[18]。以上结果均表明，不同光照萌发处理能显著影响谷物芽苗的功能活性物质。目前，关于黑青稞的研究主要集中在营养成分的测定及活性成分的提取等方面，有关光照萌发处理对黑青稞功能成分影响的研究鲜有报道。

本试验拟研究黑青稞在三种不同的光照(12 h光照/12 h黑暗、24 h 光照和24 h黑暗)条件下萌发3、5和7 d的褪黑素和酚类化合物含量以及抗氧化活性的变化、光照对黑青稞发芽率、胚根、胚芽长度和幼苗感官特性的影响，以期为黑青稞功能性食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验点概况

供试材料为黑青稞品种隆子黑，由西藏自治区农牧科学院提供。隆子黑生长在西藏高原中南部的隆子县(92°42′ E, 28°46′ N)，该区位于喜马拉雅山北侧(平均海拔3 900 m)，年日照时数为 3 014.6 h，年降水量为270.3 mm。

1.2 光照处理方法

称取100 g黑青稞，用1 g·L-1的高锰酸钾溶液消毒5 min；用纯水润洗后浸泡10 h(种子∶水=1∶20)；将浸泡后的种子移种到水培盒中，放入智能人工气候箱中，于20 ℃、相对湿度为80%萌发7 d，每隔24 h更换一次水培液。设3种光照处理：12 h光照/12 h黑暗，24 h光照，24 h黑暗，重复3次。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 胚根、胚芽长度和发芽率的测定

分别在萌发的第3天、第5天、第7天记录发芽种子数并计算发芽率；挑选10株长势一致的青稞芽苗用纯水冲洗干净、沥干，测定胚根和胚芽长度。将芽苗真空冷冻干燥，粉碎后过80目筛，装在棕色塑料器皿中，置于4 ℃冰箱保存、备用。

1.3.2 提取物的制备

根据Aguilera[19]的方法略作修改。称取0.2 g黑青稞冻干粉，加入5 mL 50%甲醇溶液震荡混匀；在黑暗、4 ℃条件下萃取20 h；将样品水浴超声30 min，离心(10 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，收集上清液，重复上述操作，合并上清液用棕色容量瓶储存，所得提取物用于褪黑素、总多酚和总黄酮含量的测定。

1.3.3 褪黑素含量的测定

褪黑素的含量(MTC)采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定。操作步骤按照Plant MT ELISA KIT试剂盒说明书进行。

1.3.4 总多酚含量的测定

总多酚含量(TPC)的测定根据Guo等[20]的方法略作修改。取提取物于试管中，加入0.1 mL Folin-酚试剂混匀，静止反应6 min；加入1 mL的7%碳酸钠溶液，用纯水调整最终体积为3.6 mL。室温下避光反应90 min，在760 nm处测定吸光度。TPC以每100 g提取物(干基)中没食子酸当量计(mg GAE·100 g-1DW)。

1.3.5 总黄酮含量的测定

总黄酮含量(TFC)的测定根据Wang等[21]的方法略作修改。取0.2 mL提取物加入试管中，添加0.2 mL 5%的碳酸钠溶液静止反应6 min；添加0.2 mL 10%的硝酸铝溶液静止反应6 min；加入2 mL 4%的氢氧化钠溶液，用纯水调整体积为3.8 mL。室温下避光反应15 min，在510 nm处测定吸光值。TFC以每100 g提取物(干基)中芦丁当量计(mg RT·100 g-1DW)。

1.3.6 抗氧化活性测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力根据Kim[22]的方法测定：制备100 mmol·L-1DPPH甲醇溶液，用80%甲醇溶液稀释为 0.1 mmol·L-1的工作液；将0.1 mL黑青稞提取液加入试管中，加入2 mL 稀释后的DPPH工作液，用80%甲醇补足体积为4 mL，混匀，于黑暗条件下反应30 min，并在517 nm处测量吸光度。以相同量的甲醇代替样品作为对照。根据Trolox标准品绘制标准曲线，计算DPPH自由基清除能力，并以Trolox当量计(mg Trolox·100 g-1)。计算公式如下：

DPPH自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

式中：A1为样品吸光度；A0为对照吸光度。

2,2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力测定：取0.031 g过硫酸钾用甲醇溶解后， 加入50 mL容量瓶中，再加入0.192 g ABTS，摇匀后室温下放置12～16 h(产生ABTS自由基)；用80%甲醇稀释使其在734 nm处吸光度为0.7±0.02(现配现用)，为ABTS工作液。取0.2 mL提取液于试管中，加入4 mL ABTS工作液，用80%甲醇溶液补足体积为5 mL，避光反应30 min，并在734 nm处测定吸光值。以相同量的甲醇代替样品作为对照。根据Trolox标准品绘制标准曲线，计算ABTS自由基清除能力，并以Trolox当量计(mg Trolox·100 g-1)。计算公式[23]如下：

ABTS自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

式中，A1为样品组吸光度；A0为对照组吸 光度。

铁还原能力根据Kim[22]的方法(ferric reducing antioxidant power，FRAP)测定：以 10∶1∶1(v/v)的比例混合0.3 mmol·L-1的醋酸钠缓冲液(pH 3.6)、0.01 mmol·L-1的TPTZ溶液(溶于40 mmol·L-1盐酸溶液)和 0.02 mmol·L-1的三氯化铁来制备FRAP溶液，使用前37 ℃下预热。取0.2 mL提取液与 4 mL FRAP工作液混合，避光反应30 min；在593 nm处测定吸光值。根据Trolox标准品绘制标准曲线，计算FRAP，并以Trolox当量计 (mg Trolox·100 g-1)。

羟自由基清除能力测定：根据赵 昊等[24]的方法略作修改。在试管中加入0.2 mL提取液、0.2 mL 9 mmol·L-1硫酸亚铁溶液和0.2 mL 9 mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液，以不加提取液作为空白对照；加入0.2 mL 8.8 mmol·L-1的过氧化氢，用去离子水补足体积3.8 mL，37 ℃水浴30 min，于510 nm处测定吸光值。提取液本底组用相同量的去离子水代替过氧化氢。用Trolox标准品绘制标准曲线，计算羟自由基清除能力，并以Trolox当量计(mg Trolox·100 g-1)。计算公式如下：

羟自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中，A1为提取液吸光度；A2为提取液本底组吸光度；A0为对照组吸光度。

1.3.7 萌发黑青稞的感官评估

参考Saleh等[13]的方法进行，采用9点标度法评估六个感官属性(外观、颜色、气味、味道、质地和总体可接受性)，极度喜欢=9，非常喜欢=8，中等喜欢=7，轻微喜欢=6，既不喜欢也不讨厌=5，轻微不喜欢=4，中等不喜欢=3，非常不喜欢=2，极度不喜欢=1。将观察结果转换为等效的数值分数进行分析，给出最终评价。

1.4 数据处理

使用Excel 2013对数据进行分析并绘制图表，使用Duncan’s进行多重比较；使用SPSS 22.0进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同光照处理对萌发黑青稞中褪黑素含量的影响

萌发后青稞芽苗中的褪黑素含量显著增加(P<0.05)(图1)。随着萌发天数的增加，褪黑素含量呈先上升后下降趋势，在萌发的第5天出现峰值，12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光条件下分别为9.5±0.81、9.3±0.74和13.11±0.04 ng·g-1DW；与萌发第5 天比较，萌发第7天芽苗中褪黑素含量均下降，24 h光照条件下褪黑素含量显著下降，下降幅度达19.89%，其次是12 h光照与12 h暗处理(下降18.63%)，避光处理的下降幅度明显较小(2.06%)。以上结果表明，萌发诱导了青稞中褪黑素的积累；其含量受光照时间的影响，避光萌发条件下黑青稞中褪黑素含量最高。

A:12 h光/12 h暗；B：24 h光；C：24 h暗；图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2、图3、图4和表1同。

2.2 不同光照处理对萌发黑青稞中总多酚含量的影响

黑青稞总多酚含量随萌发时间的增加而显著增加，增幅受光照时间影响显著(P<0.05)(图2)。在萌发第7天，总酚含量在12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光条件下分别为748.66± 3.7、371.39±3.32和842.81±3.33 mg GAE·100 g-1DW，相比种子(305.35±3.33 mg GAE·100 g-1DW)分别增加了145.18%、21.63%和176.01%，差异均显著(P<0.05)， 24 h暗条件下增加幅度最大。这说明萌发可提高黑青稞的总多酚含量；避光条件下总多酚含量最高。

图2 不同光照时间对萌发黑青稞中总酚含量的影响

2.3 不同光照处理对萌发黑青稞中总黄酮含量的影响

随萌发时间的增加，黑青稞中总黄酮含量显著增加，且增加程度受光照时间显著影响(P< 0.05)(图3)。在萌发第7天，总黄酮含量在12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光下分别为 154.03±0.73、75.32±0.88和157.31±0.53 mg RT·100 g-1DW，与未萌发前(40.38±1.26 mg RT·100 g-1DW)相比分别增加了 281.45%、86.53%和289.57%，差异均显著(P<0.05)。这表明萌发可以促进黑青稞的种子总黄酮的积累；避光条件下总黄酮含量最高。

图3 不同光照时间对萌发黑青稞中总黄酮含量的影响

2.4 不同光照处理对萌发黑青稞抗氧化活性的影响

从种子(179.18±1.08 mg Trolox·100 g-1)萌发第3天开始，无论光照时间长短，其DPPH自由基清除能力都显著增加(P<0.05)，在12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光条件下萌发7 d，其自由基清除能力分别为547.65±8.18、305.58±7.10和885.49±4.96 mg Trolox·100 g-1(图4)。黑青稞种子的ABTS自由基清除能力为50.92±7.48 mg Trolox·100 g-1，除24 h光照处理外，芽苗的ABTS自由基清除能力随着光照时间的增加显著增加(P< 0.05)，在避光萌发第7天达到232.82±1.92 mg Trolox·100 g-1。FRAP从萌发第3天开始显著增加(P< 0.05)，在12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光条件下萌发7 d，其FRAP分别为825.73±0.64、446.41±4.62和1 096.67± 1.33 mg Trolox·100 g-1。萌发青稞对羟自由基清除能力从第3天开始显著增加(P<0.05)，第5天达到峰值， 12 h光照/12 h黑暗、24 h光照和避光分别为 1 233.54±9.63、865.98±34.71和1 573.87±17.35 mg Trolox·100 g-1；在萌发第7天略有下降，其中24 h光照处理下降最为显著，比第5天下降了72.31%(P<0.05)。

图4 不同光照时间对萌发黑青稞抗氧化活性的影响

表明萌发能显著增加黑青稞的抗氧化活性，避光条件下抗氧化活性最大。

2.5 不同光照处理对黑青稞种子发芽率和芽苗生长的影响

光照时间和萌发天数对黑青稞发芽率影响均不显著，对胚根长均有显著影响(P<0.05)(表1)。在不同光照条件下，苗长19.07 cm的21.59 cm；发芽率都在第5天达到最大，其中12 h光照/12 h黑暗条件下发芽率最大，为95.00%± 4.08%。随萌发时间的延长，胚根长度显著增加(P< 0.05)，萌发第7天的平均胚根长度比第3天增加了128.87%，以避光萌发平均根长度最大 (9.57 cm)。

表1 不同光照条件下种子发芽率和幼苗生长的变化

2.6 黑青稞芽苗活性物质含量与抗氧化活性的相关性分析

采用SPSS 22软件对黑青稞芽苗中活性物质和抗氧化活性进行相关性分析，结果(表2)表明，褪黑素、总酚和总黄酮含量均与抗氧化指标(FRAP、ABTS、DPPH和羟自由基清除能力)间呈极显著正相关(R2=0.637～0.950，P<0.01)。

表2 黑青稞芽苗中活性物质与抗氧化活性的相关性

2.7 黑青稞芽苗粉的感官特性分析

对避光萌发5 d的黑青稞芽苗粉和黑青稞种子粉(图5)进行感官评定，结果(图6)，黑青稞种子粉和芽苗粉大多数属性，如颜色、气味和质地都呈现出相似的分数，且均5分；而黑青稞芽苗粉的味道和可接受性分数都低于5分。其中气味得分最高，为8分，味道得分最低，为2分。

A:黑青稞种子；B:黑青稞芽苗；C：种子粉；D：芽苗粉。

图6 黑青稞种子粉和麦芽粉的感官属性蜘蛛网图

3 讨论与结论

黑青稞是一种具有营养保健功能的特色粮食作物，符合当代人的消费观念，备受青睐。本研究中，黑青稞种子中褪黑素含量为5.88±0.05 ng·g-1，高于其他植食性种子，如水稻(1.5 0 ng·g-1)、玉米(1.88 ng·g-1)和燕麦(2.00 ng·g-1)[25]。总多酚和总黄酮含量分别为305.35±3.33 mg GAE·100 g-1和40.38± 1.26 mg RT·100 g-1，与杨希娟等[26]报道的数据相似。而且黑青稞种子也显示出很高的抗氧化活性，是一种天然的抗氧化活性食品。

萌发是植物生长发育的必需阶段，能改变种子内一些活性物质的含量(如褪黑素、总酚和总黄酮)，增加种子的抗氧化活性。Kim[22]研究发现，萌发油菜籽的褪黑素含量最高达到14.96 ng·g-1，总多酚含量最高达到19.2 mg·g-1，抗氧化活性也提高了数倍。萌发不仅增加了不同粒色青稞总酚和总黄酮含量，也提高了青稞种子的抗氧化活性[14-15]。萌发过程中新的酚类化合物和类黄酮化合物的合成导致总酚和总黄酮含量的增加[27]，这些活性物质的增加提高了其抗氧化活性。本研究结果表明，萌发提高了黑青稞褪黑素、总多酚和总黄酮含量及抗氧化能力。

光是植物生长发育的主要因素，会对植物褪黑素、总多酚和总黄酮的积累产生影响。Murch[28]首次报道了褪黑素和光照之间相互关系，发现黑暗诱导了离体圣约翰草下胚轴褪黑素的积累。避光萌发小扁豆和芸豆，发现萌发6 d后褪黑素含量均显著高于12 h光照/12 h黑暗处理[29]。避光萌发也提高了甜叶菊种子和油菜籽总酚含量[30-31]。也有研究发现，有光照时大麦根部褪黑素含量随植物生长而增加，无光照时根部褪黑素含量呈下降趋势[32]。对离体水稻叶片进行有无光照处理发现，避光处理8 d褪黑素的含量为2.1 ng·g-1，24 h光照处理8 d褪黑素含量达到275 ng·g-1[33]。李先翠等[34]研究发现，避光萌发并没有增加花生中多酚的含量；Aguilera等[29]发现，避光处理下小扁豆和芸豆中多酚的含量变化不同。以上研究结果表明，避光处理并不是对所有种子萌发过程中褪黑素和酚类物质的积累起正效应，因此想要改善芽苗菜的植物化学品质取决于很多因素，如植株的栽培品种和发芽条件等。本研究结果表明，不同光照处理均诱导了黑青稞褪黑素和酚类物质的积累，其中避光处理活性成分的增加最为显著。

不同光照处理萌发后黑青稞芽苗中褪黑素和酚类物质含量与抗氧化活性的相关性分析结果表明，褪黑素、总酚和总黄酮含量均与抗氧化指标(FRAP、ABTS、DPPH和羟自由基清除能力)间呈极显著的正相关，这也证实了黑青稞芽苗的活性物质增加，抗氧化活性也会随着提高。不同光照处理对黑青稞生长状态的影响结果表明，发芽率受光照时间的影响不显著，胚根长度随萌发时间的增加而显著增加，这与Xue等[35]的报道一致。避光处理胚根的平均长度最长，这可能归因于促进植物生长的生物活性化合物(褪黑素)的增加，Simlat等[36]也发现，在无光照条件下，褪黑素可以显著改善发芽，促进幼苗胚根的生长。黑青稞芽苗粉的气味和质地得分增加，口味得分下降，可能是萌发增加了芽苗的青草味、苦味和回味，也显示出更多的纤维性[37]。感官特性分析结果表明，避光萌发5 d的黑青稞芽苗感官评定整体可接受性为7级-中等喜欢，这与Saleh等[13]报道的不同品种豆类萌发6 d后整体可接受性感官评定介于中度喜欢和非常喜欢之间的结果相似。

本研究发现，黑青稞是一种良好的膳食褪黑素来源，避光萌发能更好的诱导黑青稞芽苗中褪黑素和酚类物质的积累和抗氧化活性的增加，感官评定分析结果表明，避光萌发5 d的黑青稞芽苗可以富含褪黑素的新型食品的开发。