小麦乙烯响应转录因子基因 wfzp突变体颖果发育的研究

冉莉萍，夏敏洁，姚慧慧，余徐润，陈 刚，熊 飞

(1.扬州大学广陵学院，江苏扬州 225000； 2.江苏省作物遗传生理国家重点实验室培育点/粮食作物现代产业技术协同创新中心/扬州大学教育部农业与农场品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009)

小麦颖果由果皮、胚、胚乳三大部分组成，它们的发育彼此不同却又密切关联，共同影响颖果的发育[1]。胚乳为颖果的主要部分，占颖果总重量的85%以上，其主要成分是淀粉和蛋白质，分别积累在淀粉体和蛋白体中，淀粉体和蛋白质的发育状况直接影响小麦的产量和品质[2]。Brown等[3]研究发现，在小麦颖果的发育过程中，胚乳细胞呈现数目增加、细胞体积增大以及淀粉体和蛋白质体充实等现象。

小麦叶片光合作用制造的光合产物由茎进入小穂轴，最后由母体养分运输组织(包括果皮维管束、合点、珠心突起传递细胞)和子代养分运输组织(包括传递细胞、胚乳输导细胞和糊粉层)运输至胚乳中[1]。研究表明，随着颖果的发育和胚乳的灌浆充实，维管束附近的珠被和部分珠心组织分化形成合点-珠心突起-珠心突起传递细胞；而胚乳表层细胞则分化为糊粉层、糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞[4]。王慧慧等[5]和王 兵等[4]利用光镜和透射电镜观察相结合，系统地追踪了颖果发育过程中养分运输组织的结构变化；Radchuk等[6]研究发现，Jekyll基因编码的一种特殊蛋白在珠心突起细胞的形态建成过程中起决定性的作用；Yu等[7]也证实了糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞具有吸收和运输养分的功能。

乙烯响应因子(ERF)是植物中特有的一类转录因子，是AP2/ERF超家族中的1个亚族，其内部含有1个AP2结构域。近年来研究发现，AP2/ERF家族成员参与粮食作物的生长发育过程。如OsERF基因与水稻胚乳糊粉层中特异表达的转录因子OsNF-YB1发生互作，对调控籽粒灌浆和胚乳发育有重要作用[8]；OsEATB基因能够降低成熟期水稻的株高和穂长，增加小穂的分枝数，从而提高粮食产量[9]；OsAP2基因的过表达能够提高水稻的籽粒填充率和籽粒产量[10]；转录因子OsEBP-89和RSR1对胚乳细胞中淀粉的含量、结构、淀粉颗粒形态等特性有重要作用[11-12]。Li等[13]发现，ERF类转录因子ZmEREB94调控玉米籽粒淀粉合成相关基因的表达。Liu等[14]和高 天等[15]分别发现，AP2/ERF家族中的成员TaRSR1和TaERF1a基因与灌浆期小麦籽粒淀粉的合成密切相关，其表达水平高低会直接影响淀粉的含量。

小麦WFZP基因编码的是一类ERF，该基因的功能缺失会引起小麦幼穂护颍原基与外稃原基之间产生侧生组织原基，并进一步发育成侧小穂，从而提高穂粒数[16]。Li等[17]研究发现，小麦WFZP基因突变后可以直接或间接地调控花序分生组织的活性和小穗数；同时汪 莹等[23]还发现WFZP基因通过影响TaGW5和TaGW8等基因的表达来调控细胞分裂，从而影响粒宽。小麦穂的发育与穂小花数、籽粒结实率、同化物分配、碳水化合物的代谢等密切相关[18]。目前，小麦WFZP基因已被克隆，其在小麦穗发育调控中的重要功能已得到解析，然而关于WFZP基因突变后对小麦颖果发育影响的报道很少。因此，本研究利用EMS诱变的小麦wfzp基因突变体为材料，系统分析该突变体小麦颖果发育过程中形态结构的变化，以期深入了解WFZP基因在小麦颖果发育中的功能，为小麦EMS诱变育种提供了形态学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的两个突变体材料由烟台吉恩生物科技有限公司提供，为栽培小麦品种济麦22 EMS诱变后选出的株系，经M5代筛选鉴定获得的稳定遗传纯合突变系。其中，纯合突变体1是2B染色体103196377位点的C碱基突变为T碱基(命名为wfzp1)，纯合突变体2是2A染色体66849157位点的C碱基突变为T碱基(命名为wfzp2)。野生型小麦品种济麦22为本试验对照株系。小麦于2019-2020年度种植在江苏省作物栽培生理重点实验室的试验田中，小麦生长期间进行常规管理，保证肥水充足，于开花期采用记号笔点颖与植株挂牌相结合的方法正确标记开花日期。

1.2 颖果鲜干重、可溶性糖和总淀粉含量的测定

采集花后7、10、12、15、20和25 d的颖果,测定鲜重后，将其置于鼓风干燥箱中，105 ℃杀青 1 h，在42 ℃下烘干至恒重(干重) 。

选取成熟小麦籽粒，于105 ℃杀青2 h后， 70 ℃烘干。将烘干样品研磨成粉，过100目金属网筛，称取200 mg粉末，采用蒽酮比色法测定可溶性糖和总淀粉含量[19]。

1.3 颖果的显微结构观察

参考Yu等[7]的方法，取不同发育时期的小麦颖果，从中部切断，迅速置入2.5%戊二醛溶液前固定12 h。用磷酸缓冲液(PBS，pH=7.2)清洗三次，每次10 min。清洗后的样品经20%、40%、60%、80%、90%和100%的乙醇梯度脱水(每次30 min，100%乙醇脱水三次)、环氧丙烷置换、Spurr树脂浸透与包埋。包埋好的样品置于70 ℃烘箱中聚合12 h，然后将聚合好的样品用超薄树脂切片机(徕卡,德国)切1 μm厚的切片，用0.5%甲基紫染色10 min后在光学显微镜下拍照，图像采集后进行数据分析。每个材料选取3个颖果作为重复,每个颖果来自不同麦穗。

1.4 胚乳中充实物质数量特征统计

参照Yu等[7]的方法,利用Photoshop CS6软件与Image-Pro Plus软件相结合，统计分析胚乳细胞中淀粉体和蛋白体的相对面积。每个样品统计3粒颖果作为重复,每粒颖果拍摄3张显微图片用于数据统计。

1.5 数据分析

用 SPSS 19.0软件对数据进行处理，同时对不同样品间测量值的差异在0.05 水平上进行显著性检验(LSD 法)。

2 结果与分析

2.1 WFZP基因突变后颖果及果皮的生长发育特征

由图1可以看出，小麦颖果表面的颜色随着颖果发育呈现出白色-绿色-黄绿色的变化。花后7～12 d颖果形态变化较大，不断纵向膨胀生长，果皮发育早期呈乳白色。发育至花后15 d左右时，颖果纵向生长基本恒定，然后横向生长，果皮颜色由白变绿。花后20～25 d，颖果基本成型，无明显形态变化，果皮颜色逐渐由绿色变为黄绿色。与济麦22相比，在相同的发育阶段，wfzp1和wfzp2突变体颖果果皮颜色较深。这说明小麦WFZP基因突变体的颖果生长速度快，使得颖果发育期缩短，提前成熟。

wfzp1和 wfzp2：突变体；JM22：济麦22(野生型)。下同。标尺=5 mm。

由表1可以看出，随着颖果发育，wfzp1和wfzp2突变体和济麦22的鲜重均呈上升趋势，干重和含水量均呈先上升后下降的变化趋势。wfzp1和wfzp2突变体颖果鲜重、干重在各个发育时期均显著高于济麦22(除花后7 d，wfzp1突变体与济麦22无显著差异外)，而含水率则低于济麦22，在花后7、12和25 d，差异均达到显著水平(表1)。wfzp1和wfzp2突变体成熟籽粒中总淀粉含量和可溶性糖含量也存在差异，其中总淀粉含量分别为77.82%和81.34%，含量均高于济麦22(76.06%)，且wfzp2突变体与济麦22差异显著；三者的可溶性糖含量间无显著差异，这说明WFZP基因在颖果发育过程中参与胚乳储藏物质(尤其是淀粉)的积累。

表1 花后不同天数小麦颖果鲜重、干重及含水率的变化

2.2 WFZP基因突变后颖果果皮的发育特征

WFZP基因突变后，在小麦颖果果皮发育过程中，淀粉积累与降解、果皮细胞凋亡以及横细胞形态等方面均发生了明显变化(图2)。

外果皮位于果皮的最外层，起保护作用。花后7 d，济麦22外果皮细胞中积累着大量的淀粉体(图2C1)；花后10～12 d，淀粉体逐渐降解，数量减少(图2F1和I1)。与济麦22相比，颖果发育早期，wfzp1突变体外果皮细胞有少量淀粉体(图2A1、D1和G1)，而wfzp2突变体外果皮细胞中几乎没有淀粉体(图2B1、E1和H1)。花后 15～25 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体外果皮细胞内的淀粉体几乎降解，并出现加厚的细胞壁(图2J1～R1)。

中果皮是果皮的主要组成部分，淀粉体主要在中果皮细胞中积累。从图2中可以看出，wfzp1和wfzp2突变体中果皮中淀粉粒积累量少、果皮细胞尺寸小、中果皮细胞凋亡进程快(图2A2～R2)。花后7 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体中果皮细胞中积累大量的淀粉体，并且在中果皮和内果皮的空隙间还存在大量游离分布的淀粉体(图2A2～C2)。花后10～12 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体小麦颖果中果皮细胞均开始凋亡，并出现凋亡空腔，细胞中的淀粉体开始降解，数量减少(图2D2～I2)，其中济麦22中果皮细胞中淀粉体尺寸大，有大量未降解的淀粉体充斥在细胞凋亡的空腔中(图2F2和I2)，而wfzp1和wfzp2突变体中果皮凋亡空腔中剩余的淀粉体明显较少(图2D2、E2、G2和H2)。花后15 d，wfzp1和wfzp2突变体中果皮细胞基本完全降解，仅在济麦22中存在未降解的淀粉体，分布在横细胞以及外果皮和横细胞的空隙间(L2)。这说明WFZP基因突变会加快小麦颖果中果皮细胞的凋亡速度及其细胞中淀粉体的降解速度。花后20 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体中果皮细胞完全消失，仅存在凋亡空腔，在空腔和内果皮之间还有少量未降解的淀粉体(图2M2～O2)。花后25 d，中果皮淀粉体逐渐完全降解(图2P2～R2)。

SG：淀粉体；EP：外果皮；ME：中果皮；TC：管细胞；CC：横细胞。图左侧显示的均为花后天数。标尺=20 μm。图3和图5同。

内果皮由横细胞和管细胞两部分构成，分别由果皮内部的上皮细胞及靠近上皮细胞的单层细胞发育而来[7]。从图2可以看出，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体内果皮的横细胞会随着颖果的发育变成瘦长形，形状比较规则，细胞质颜色逐渐变淡(图2A3～R3)。花后7～12 d，wfzp1突变体内果皮中的管细胞随着颖果的发育逐渐消失(图2A3、D3和G3)；与wfzp1突变体相比，济麦22内果皮中的管细胞消失速度较慢，花后25 d还没有完全消失(图2C3、F3、I3、L3、O3和R3)；而wfzp2突变体内果皮中的管细胞不会消失，一直存在(图2B3、E3、H3、K3、N3和Q3)。以上观察结果说明，WFZP基因在2B染色体上的突变能够在小麦颖果发育早期促进内果皮细胞的发育，使wfzp1突变内果皮管细胞降解速度较快；而在2A染色体上的突变则会抑制内果皮细胞的发育，使wfzp2突变体内果皮管细胞发育缓慢，这说明不同染色体上WFZP基因位点的突变对小麦颖果果皮发育的影响存在明显差异。

2.3 WFZP基因突变后颖果胚乳的发育规律

小麦胚乳的发育过程主要包括胚乳细胞的分裂、生长以及胚乳细胞中淀粉体和蛋白体的充实。从图3可以看到，花后7 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体内、外胚乳细胞开始分化，细胞核明显，且细胞中已经积累了少量的小淀粉体(图3A1～C1、A2～C2)。花后10～12 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体细胞开始生长分化，此时，内、外胚乳细胞中淀粉体积累量增多，体积变大，且大多聚集在细胞壁周围，其中wfzp1和wfzp2突变体细胞中开始积累蛋白体(图3D1、D2、E1、E2、G1、G2、H1和H2)，而济麦22内、外胚乳细胞中尚未积累蛋白体(图3F1、F2、I1和I2)。胚乳细胞中淀粉体和蛋白体相对面积统计结果表明，wfzp1和wfzp2突变体胚乳的蛋白体比济麦22出现时间早，且花后7～12 d，淀粉体和蛋白体相对面积都明显高于济麦22(图4)。花后15 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体蛋白体和淀粉体的积累量变多(图3J1～L1、J2～L2)，此时wfzp1突变体的内胚乳淀粉体相对面积明显大于wfzp2突变体，但两个突变体胚乳中的总蛋白体和总淀粉体相对面积仍明显大于济麦22，且wfzp2突变体大于wfzp1突变体(图4)，这说明胚乳细胞中淀粉的积累受WFZP基因影响较大。花后20 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体蛋白体互相靠近，融合形成大的蛋白体，且细胞中胚乳淀粉进一步充实，同时还分化出了一些小淀粉体(图3M1～O1、 M2～O2)；此时， 济麦22内胚乳细胞中蛋白体相对面积超过wfzp2突变体，但在总蛋白体相对面积上无明显变化(图4)。花后25 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体淀粉体之间相互挤压变形，蛋白体体积增大，相互聚集，充实在淀粉体间隙，使胚乳结构变得更加致密(图3P1～R1、P2～R2)，此时，除wfzp1和wfzp2突变体内胚乳蛋白体相对面积小于济麦22外，两个突变体胚乳中的蛋白体和淀粉体的相对面积均明显大于济麦22(图4)，这说明WFZP基因突变体胚乳细胞贮藏物质积累量多，胚乳细胞充实度高。

SG：淀粉体；PB：蛋白体。

图4 wfzp突变体内、外层胚乳细胞中蛋白体和淀粉体相对面积的变化

2.4 WFZP基因突变后颖果糊粉层传递细胞与胚乳传递细胞的发育过程

在小麦胚乳灌浆充实期，养分经珠心突起传递细胞传递至颖果中的胚乳腔中，然后通过子代养分运输组织(糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞)运输至胚乳。糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞是由胚乳腔最外面的1～2层胚乳表皮细胞分化而来，它们为胚乳中储藏物质的充实提供了结构基础[4]。从图5可以看出，花后7 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体胚乳腔的胚乳表层细胞进入细胞分裂期，有明显的细胞核和浓稠的细胞质(图5A1～C1、A2～C2)。花后10 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞的细胞壁出现增厚现象，wfzp1和wfzp2突变体糊粉层传递细胞的部分部位出现壁内突(图5D1、E1)，胚乳传递细胞中也积累了较多的淀粉体(图5D2、E2)；与两个突变体材料相比，济麦22糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞的发育明显较慢，糊粉层细胞未出现壁内突，胚乳传递细胞中的淀粉体也较少(图5F1、F2)。花后12～25 d，济麦22、wfzp1和wfzp2突变体糊粉层传递细胞的细胞壁进一步加厚，细胞壁内突清晰可见；胚乳传递细胞的体积变大，胞内积累的淀粉体数量多且体积大(图5G1～R1、G2～R2)。从子代传递细胞发育程度来看，wfzp1和wfzp2突变体传递细胞壁内突的细胞数量和厚度均高于济麦22，同时胚乳传递细胞中淀粉体积累也较多。以上结果表明，wfzp1和wfzp2突变体颖果中糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞的发育状况好于济麦22，有利于颖果中胚乳贮藏物质的充实。因此，综合以上结果可以发现，WFZP基因突变的小麦品种具有较高发育程度的子代养分运输组织，更有利于灌浆期营养物质向胚乳中输送和颖果营养物质的积累，这可能是wfzp1和wfzp2突变体灌浆快、胚乳充实程度高的重要原因之一。

ATC：糊粉层传递细胞；ETC：胚乳传递细胞；TW：加厚的细胞壁；SG：淀粉体。

3 讨 论

AP2/ERF是植物所特有的最大转录因子家族之一，因其在基因育种等方面有重要作用而倍受关注。目前，已在多种植物中开展了对AP2/ERF转录因子家族成员的鉴定和功能研究[20-21]。有研究发现，AP2/ERF家族转录因子参与植物种子发育的过程[22]。汪 莹等[23]指出，编码AP2/ERF的基因突变后可直接或间接调控果实成熟。本研究发现，在颖果发育早期，与野生型济麦22相比，wfzp1和wfzp2突变体颖果果皮颜色较深，颖果果皮细胞中的淀粉积累量比野生型高，果皮细胞凋亡速度也比野生型快。这说明在小麦颖果发育过程中，wfzp基因突变能够加速颖果成熟，导致颖果灌浆时间缩短。本研究还发现，花后 20 d以后，wfzp2突变体果皮发育进程受到了一定程度的抑制，而wfzp1突变体则无明显变化，这说明wfzp基因不同位点的突变所带来的表型不同。在前人的研究中也有类似的报道结果，如Liu等[24]深入挖掘了大量番茄品种的RNA测序数据指出，在番茄成熟的过程中，ERF转录因子突变后其表达模式不同，进而使其功能发生改变。

胚乳是小麦颖果储藏物质积累的重要部位，其发育过程主要包括胚乳细胞数目的增加、细胞体积的扩大、淀粉体和蛋白质体的充实等。Jofuku等[20]研究发现，AP2基因的缺失导致种子的尺寸、重量、蛋白质总含量和含油量均显著升高。也有研究认为，该基因突变后通过调控种皮细胞的延伸来控制种子大小，同时种子中己糖与蔗糖含量的比例也发生了改变[25]。AP2/ERF 家族的成员RSR1负调控淀粉合成基因的表达，该基因缺失会导致种子变大、直链淀粉含量增加以及支链淀粉结构发生改变[12]。在本研究中，wfzp1和wfzp2突变体颖果发育早期，胚乳细胞中淀粉体和蛋白体积累时间早、速度快，且淀粉体和蛋白体相对面积均显著高于野生型济麦22；颖果发育后期，突变体中的淀粉体和蛋白体的充实度更高，这说明WFZP基因的突变能够在颖果发育时促进胚乳细胞的分化和生长。因此，推测AP2/ERF家族的WFZP基因可以通过调控颖果的发育，进而影响胚乳中淀粉和蛋白的积累。

前人探究了胚乳灌浆充实的整个过程，证实了糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞具有吸收和运输养分的功能，对颖果的灌浆和储藏物质的积累有重要的作用[5]。在本研究中，wfzp1和wfzp2突变体糊粉层传递细胞和胚乳传递细胞的生长发育速度较快，细胞壁内突的数量和厚度均高于济麦22，更有利于灌浆物质的运输，从而提高胚乳细胞中贮藏物质的积累速率。这说明wfzp1和wfzp2突变体养分运输组织的结构发育特征与胚乳细胞中物质快速积累和大量充实紧密相关。本研究认为，WFZP基因参与了小麦颖果发育过程，对颖果内部贮藏物质的积累有一定调控作用，但有关该基因在小麦颖果发育过程中执行的生物学功能尚不清楚，需要通过进一步的功能验证来确定，本试验可为进一步研究 AP2/ERF家族转录因子在谷物颖果发育过程中的功能提供理论 依据。