姜黄素抑制自噬对骨肉瘤耐药细胞增殖、凋亡的影响

陈祖旺，林 晶,陈雅君,黄志鹏,王 斌

骨肉瘤是青少年较常见的原发于骨间充质的恶性肿瘤，化疗是其主要治疗方法，可以使患者的保肢率>68%[1]，但原发或者继发的肿瘤多药耐药常阻碍化疗药物疗效的发挥，且机制复杂多样[2]，近期的研究[3]显示，自噬在肿瘤多药耐药中起关键的调节作用。姜黄素是一种从姜科植物姜黄根茎中提取得到的酚性色素，可以通过多种通路调控肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡[4]，甚至在一些肿瘤多药耐药细胞中也能发挥抗肿瘤活性，是一种具有良好开发前景的抗肿瘤药物[5]。本研究观察姜黄素抑制自噬对骨肉瘤耐药细胞增殖、凋亡的影响，旨在为肿瘤多药耐药骨肉瘤患者寻找新的潜在治疗药物。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、试剂和仪器人骨肉瘤MG-63 细胞购自中国科学院上海细胞库。姜黄素、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亚砜购自Sigma-Aldrich公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；微管相关蛋白Ⅰ/Ⅱ轻链3(LC3Ⅰ/Ⅱ)抗体、内参GAPDH抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞培养箱购自SANYO公司；Elx800全波长酶标仪购自Bio Tek公司；Quanta SC流式细胞仪购自贝克曼库尔特公司。

1.2 顺铂耐药细胞的构建采用药物浓度递增诱导法[6]构建MG-63顺铂耐药细胞株(MG-63/DDP)，步骤如下：取对数生长期MG-63细胞接种于6孔板，每孔105个细胞，培养于10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 g/L链霉素的DMEM培养液中，细胞贴壁后，更换含0.5 μmol/L顺铂培养液，约1个月细胞生长稳定后，增加顺铂浓度为1 μmol/L，依次逐渐增加到2 μmol/L，直到MG-63细胞可以在2 μmol/L顺铂环境中稳定生长和传代4～6个月，此细胞为MG-63/DDP细胞。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期MG-63细胞和MG-63/DDP细胞，接种到96孔板，每孔103个细胞，过夜细胞贴壁后，加入0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L对倍稀释的顺铂，继续培养48 h，每孔加入0.5 g/L MTT，继续孵育培养4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲基亚砜溶解结晶，酶标仪570 nm 波长处检测每孔光密度值，计算顺铂对MG-63细胞和 MG-63/DDP细胞的半数抑制浓度(IC50值)。实验数据录入Excel软件，采用Bliss法计算IC50。

1.4 实验分组及细胞凋亡检测实验分为A、B、C、D 4组：① A组——将MG-63细胞接种到6孔板，每孔105个细胞，细胞贴壁后加入10 μmol/L顺铂；② B组——将MG-63/DDP细胞接种到6孔板，每孔105个细胞，细胞贴壁后加入10 μmol/L顺铂；③ C组——将MG-63/DDP细胞接种到6孔板，每孔105个细胞，细胞贴壁后加入2 μmol/L姜黄素；④ D组——将MG-63/DDP细胞接种到6孔板，每孔105个细胞，细胞贴壁后加入2 μmol/L姜黄素+10 μmol/L顺铂。培养48 h后，4组均用胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，使用凋亡检测试剂盒检测各组细胞凋亡率的变化。膜联蛋白V(Annexin V+)以及Annexin V+碘化丙啶(PI+)细胞均为凋亡细胞，使用流式细胞仪检测凋亡细胞占比。

1.5 Western blot检测蛋白表达4组细胞培养48 h后，胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞2次，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，100 ℃水浴20 min，每个样品取10 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移到阳离子尼龙膜，孵育LC3Ⅰ、LC3Ⅱ或GAPDH一抗，过夜，4 ℃孵育二抗1 h，X线下曝光，AI600 Images软件检测目的条带，以内参为对照计算LC3Ⅱ蛋白相对表达量与LC3Ⅰ蛋白相对表达量的比值(LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ)。

2 结果

2.1 顺铂对MG-63细胞和MG-63/DDP细胞增殖抑制的影响见图1。顺铂对MG-63细胞和MG-63/DDP细胞的IC50值分别为4.04～7.62(5.14±1.02)、10.63～14.25(12.42±1.52) μmol/L，两者比较差异有统计学意义(t=12.315，P<0.01)。

图1 顺铂对MG-63细胞和MG-63/DDP细胞增殖抑制的影响

2.2 姜黄素促进顺铂诱导MG-63/DDP细胞凋亡的检测见图2。细胞凋亡率A～D组分别为25.54%～36.48%(30.26%±4.15%)、9.26%～13.33%(11.32%±1.64%)、0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)和19.24%～27.06%(22.72%±3.36%)，各组整体比较差异有统计学意义(F=6.814，P<0.01)；细胞凋亡率D组明显高于B组(t=11.312，P<0.01)。

图2 姜黄素促进顺铂诱导MG-63/DDP细胞凋亡的检测

2.3 姜黄素对MG-63/DDP细胞自噬的抑制作用见图3、4。LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值A～D组分别为0.27～0.45(0.36±0.07)、2.44～4.53(3.54±0.72)、0.52～1.62(1.13±0.46)和0.77～1.91(1.32±0.52)，各组整体比较差异有统计学意义(F=3.216，P<0.05)；LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D组均明显高于A组(P<0.01)，且B组明显高于C、D组(P<0.01)。

图3 LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白的Western blot检测

图4 4组LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值分析 与A组比较：**P<0.01；与B组比较：▲▲P<0.01

3 讨论

骨肉瘤化疗方案多含有铂类药物，其耐药机制复杂[7]，自噬是细胞程序性死亡的途径之一，近期研究[8]显示，自噬可以参与肿瘤耐药的调控，长期使用顺铂可以诱导自噬，激活丝裂原活化蛋白激酶参与骨肉瘤细胞耐药[9]，而且抑制骨肉瘤细胞自噬可以逆转肿瘤耐药[10]。本研究使用药物浓度递增诱导法构建MG-63/DDP细胞株，结果显示顺铂对MG-63/DDP细胞的IC50值显著高于MG-63细胞，说明诱导耐药的产生，MG-63/DDP细胞可以用于后续实验。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ是自噬的标志性蛋白，自噬增强时LC3-Ⅰ可由蛋白酶Atg4切割经修饰形成PE结合型LC3-Ⅱ，使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值可以反映出细胞自噬的激活状态[11]。本研究中的自噬蛋白Western blot分析显示，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D组均显著高于A组，说明了MG-63/DDP细胞处于自噬激活状态。

姜黄素是从姜科植物姜黄的根茎中提取的一种酚性天然色素，研究[12]显示，姜黄素可以抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡，在胃癌的研究[13]中发现，姜黄素可以调节胃癌AGS细胞的自噬通路发挥抗肿瘤效果，而且在一些耐药肿瘤细胞中也可以发现姜黄素对自噬通路的调节作用[14]。本研究中， LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值C、 D组显著低于B组，说明姜黄素可以抑制MG-63/DDP细胞自噬通路的激活；细胞凋亡分析显示，细胞凋亡率D组显著高于B组，提示抑制了MG-63/DDP细胞自噬激活后，顺铂对MG-63/DDP细胞的致凋亡作用显著增加，上述结果预示姜黄素可以克服骨肉瘤细胞的多药耐药。本研究中， 细胞凋亡率C组只有0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)，说明本实验剂量的姜黄素对细胞生长无显著影响，文献[15]显示，姜黄素是一种高效低毒的抗肿瘤药物，对人体几乎没有副作用，是一个有前景的抗肿瘤临床开发候选药物。

综上所述，姜黄素可以抑制MG-63/DDP细胞自噬激活，促进顺铂诱导的骨肉瘤细胞多药耐药细胞凋亡。