实时荧光PCR与基因芯片法检测人乳头瘤病毒的方法学比较

麦艳媚 (鹤山市人民医院，广东 江门 529000)

人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是专门感染人表皮与黏膜鳞状上皮的一种病毒，性行为是其主要传播途径，其次为唾液与皮肤接触[1]。高危型HPV感染已被证实为宫颈上皮内增生及宫颈癌发生与发展的主要致病因素，超过90%的宫颈癌与HPV感染有关，宫颈脱落细胞HPV DNA的检测已成为宫颈癌的筛查方案与指引[2-3]。最新研究显示宫颈癌有较长时间的可逆转癌前病变期，及早发现及时有效治疗后，患者五年治愈率达到90%。大量资料证明低危型HPV可导致生殖器尖锐湿疣，高危型HPV的持续感染是宫颈癌以及宫颈上皮内瘤变的主要致病原因[4-5]。因此，通过女性生殖道HPV检测筛查以及分型检测，能够有效预防、降低宫颈癌发病率，给临床疾病分流提供依据[6]。目前检测HPV的方法众多[7]，不同的HPV检测方法，会因其对HPV亚型基因数量检测结果的不同导致阳性检出率出现一定差异。本研究对临床上常用的实时荧光PCR技术与基因芯片法在HPV检测中的效果进行比较分析。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择我院2018年6月～2020年6月期间的患者作为研究对象，所有患者均做液基细胞学检测。年龄23～71岁，平均(37.25±7.92)岁。试剂与仪器：实时荧光PCR试剂盒由安徽同科生物科技有限公司提供，基因芯片试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供；扩增仪是安徽同科生物科技有限公司提供的TK-6000，杂交仪是深圳亚能生物技术有限公司提供。

1.2方法

1.2.1标本采集方法:所有患者用窥阴器暴露宫颈，无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦拭去除宫颈口过多的分泌物，宫颈刷刷取宫颈口的脱落细胞，细胞保存液保存待测。用含Thinprep细胞保存液再保存一份细胞用于液基细胞学检测。

1.2.2基因芯片法:充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。把洗脱液全部转移至1.5 ml的离心管中，13 000 rpm离心10 min，弃去上清，保留管底的细胞沉淀。加入100 μl病毒裂解液，混匀后100℃加热10 min，13 000 rpm离心10 min，保留上清液待用。于反应Ⅰ和反应Ⅱ加入制备好的上清液各5 μl,阴阳质控品同等处理，低速离心数秒待扩增。PCR扩增仪反应条件设置：50℃15 min;95℃10 min;(94℃30 s,42℃90 s,72℃ 30 s)共40个循环，72℃ 5 min，4℃下保存。取扩增的全部PCR产物导入，将标记有HPV6、11、42、43、81、83(低危型)及16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82(高危型)等23种寡核酸探针的基因芯片，严格按照试剂盒进行导流杂交后，酶标仪显色处理。观察芯片上HPV分型分布所对应的阳性点，并对HPV亚型进行判断，明确相应组织中的HPV亚型分布情况。

1.2.3实时荧光PCR法:按照试剂盒说明书对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68等15种高危型HPV进行检测。

2 结果

2.1两种方法HPV阳性率检测结果比较:本研究中，采用基因芯片法检出HPV阳性率为23.29%(17/73)，其中15种高危型HPV感染的阳性率为13.70%(10/73)；差异无统计学意义(P>0.05)。同时采用两种方法检测的共有73例，两种方法对15种高危型HPV检出均为阳性的有24例，不符合的为2例。其中基因芯片法阳性率为35.62%(26/73)，荧光PCR法为32.88%(24/73)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两种方法在不同TCT分型中的HPV感染阳性率检出结果比较:TCT分级各组中的基因芯片法与荧光PCR法的高危型HPV感染阳性检出率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两种方法在不同TCT分型中的HPV感染阳性率检出结果比较[例(%)]

2.3两种方法对HPV感染的诊断价值：基因芯片法对HPV感染阳性的诊断敏感度、特异度、准确度分别为98.75%、98.675、98.69%；荧光PCR法的敏感度、特异度、准确度分别为97.50%、99.47%、96.77%，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

目前，HPV基因亚型已鉴定出的有100多种，有40多种HPV亚型可侵犯女性生殖道，被称为生殖道HPV，按照其致癌性强弱又分为高危型、低危型等。多数女性HPV感染期不长，处理无临床感染状态、亚临床感染状态，当受损的宫颈上皮持续存在HPV感染情况时，会使宫颈上皮出现不典型增生，并引发癌变[5]。部分低危型如HPV6、HPV11的感染可引起尖锐湿疣，HPV16、HPV18型的持续感染被认为是宫颈癌的高危因素，可以预测子宫病变的进展和预后，因此，HPV亚型的检测对于临床诊断分流均有一定的参考依据。

本实验中实时荧光PCR法是将荧光基团加入PCR反应体系中，基于多重荧光PCR技术，通过荧光信号的累积进行实时监测，在四种PCR反应混合液中分别采用四种荧光通道共检测15种HPV及人β-珠蛋白(HBB)基因，其中HPV16/58/35/HBB-PCR反应液中FAM荧光通道检测HPV16,接(或HEX)荧光通道检测HPV58,ROX荧光通道检测HPV35,CY5荧光通道检测HBB;同样原理能具体检测HPV的各个亚型。实时荧光PCR能做到对15个HPV亚型的同时检测并能分出具体型别，操作简单，耗时短，适合做大规模的筛查。基因芯片法是采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的HPV基因分析检测技术，将扩增产物与固定在膜条上的23种HPV分型探针杂交，依据杂交信号的有无判读结果。基因芯片可采用高通量技术对基因进行大规模检测，目前被广泛应用于肿瘤检测与研究中[8]。Meta分析显示，基因芯片法对HPV感染的检测门诊患者HPV感染的敏感度为0.97(95%CI:0.96～0.98)，特异度为0.96(95%CI:0.96～0.97)，诊断优势比为878.72(95%CI:317.14～2434.73)；检测宫颈癌患者HPV感染的敏感度为0.99(95%CI:0.97～1.00)，特异度为0.80(95%CI:0.75～0.84)，诊断优势比为166.19(95%CI:9.64～2863.74)，具有很高的准确性，但也有一定的假阳性与假阴性情况[9]。目前研究显示，荧光PCR法不区分亚型与基因芯片法在高危型HPV感染阳性诊断中具有很高的一致性[10]，本研究也显示，荧光PCR法可区分亚型与基因芯片法也具有很高的一致性。本实验中荧光PCR法采用荧光探针法通过不同荧光通道来区分亚型，操作简单，耗时短，被用于我院的大规模人群筛查。基因芯片法同时能检测23种亚型，比荧光PCR法多8种亚型，故后者检测阳性率对高于前者。不同亚型临床的处理不一样，后者更符合临床的需求，被用于临床对疑似HPV感染患者的检测。

综上所述，实时荧光PCR与基因芯片法对HPV阳性检出情况高度一致，尤其在高危型HPV检测中，均有良好的诊断效能，根据实际情况，合理选择检测方法，均能够对宫颈病变作出及时有效的诊断。