静电纺丝结合热诱导交联制备的抗菌吸水衬垫对冷鲜肉的保鲜效果

于 栋，常婧瑶，陈佳新，王 浩，孔保华，夏秀芳，刘 骞

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

冷鲜肉是指对严格执行兽医卫生检疫制度屠宰后的畜体迅速进行冷却处理，使肉温在24 h内降为0～4 ℃的生鲜肉，也称之为排酸肉、预冷肉[1]。冷鲜肉因其具有鲜嫩、美味、安全、卫生等优点而深受消费者喜爱[2]。普通有氧托盘包装是超市小块分割肉展销的常用包装方式，该包装方式简洁方便[3]。但是冷鲜肉存放一段时间后会渗出大量肉汁降低冷鲜肉感官品质，此外，肉汁积聚于托盘底部会导致微生物快速繁殖使冷鲜肉产生异味，缩短货架期，严重影响商业价值[4-6]。目前无尘纸吸水垫被广泛应用于托盘包装冷鲜肉的贮藏过程中，其是以全木浆纤维为原料采用气流成网的技术制备的非织造布，在制作过程中使用空气作为分散和输送纤维的介质，依靠高分子粘合剂或热熔性纤维本身熔融结合使纤维固定在网帘上制成[7]。然而无尘纸吸水垫的生产工艺相对复杂，并且不能有效抑制微生物生长繁殖。

近年来，静电纺丝技术作为一种纳米纤维膜的制备方法在食品领域备受关注。在纺丝的过程中聚合物溶液受到电场力的作用被拉伸固化，最终在接收装置表面形成一层纳米纤维膜[8-9]。通过静电纺丝技术制备的吸水垫具有良好的包埋特性且孔隙率、比表面积大[10-11]，可作为一种新型吸水保鲜材料应用于冷鲜肉保鲜领域。利用静电纺丝技术制备的吸水垫具有较高的吸水溶胀能力，但是其空间结构稳定性较低，因此在成膜的过程中通常结合热诱导交联技术来提高静电纺丝吸水垫的结构稳定性。Dharmalingam等[12]以柠檬酸（citric acid，CA）为交联剂，利用热诱导原位交联的方式制备羧甲基纤维素钠/羟丙基甲基纤维素水凝胶膜，研究结果发现CA交联可以提高水凝胶膜在水中的稳定性。Cumming等[13]以CA为交联剂制备了胶原蛋白纳米纤维膜，其结果表明交联处理可以显著提高胶原蛋白在水中的稳定性。López-Córdoba等[14]以CA为交联剂制备了淀粉/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）生物复合膜，研究表明该方法是制备淀粉基活性食品包装材料的有效途径。

本实验基于静电纺丝技术结合热诱导交联的方式制备了具有高吸水性的抑菌吸水垫。首先研究无尘纸吸水垫和不同CA交联浓度下静电纺丝吸水垫的溶胀性和溶胀损失，为进一步研究静电纺丝技术的优势，将具有抑菌作用的丁香精油包埋到静电纺丝吸水垫中，在4 ℃条件下使用无尘纸吸水垫和静电纺丝抑菌吸水垫分别对冷鲜肉进行包装保鲜处理，比较10 d内两种吸水垫包装的冷鲜肉菌落总数、pH值、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、颜色和挥发性气味等。以期为将静电纺丝抑菌吸水垫应用于冷鲜肉贮藏保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪里脊肉购自哈尔滨比优特超市；市售生鲜无尘纸吸水垫购自上海通贝吸水材料有限公司。

平板计数琼脂 青岛高科园海博生物技术有限公司；CA 国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA） 上海迈瑞尔化学技术有限公司；丁香油（clove oil，CO） 中国双香助剂厂。

1.2 仪器与设备

DFS-001高压静电纺丝机 北京新凯伟科技有限公司；SU8010扫描电子显微镜 日本日立集团；JEM-1230透射电子显微镜 日本电子株式会社；Nicolet iS-50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；RW20机械搅拌机 德国IKA公司；电子分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；水浴锅 余姚市东方电工仪器厂；ZE-6000型色差仪 日本登宿株式会社；PEN3便携式电子鼻气味分析仪 德国AIRSENSE公司。

1.3 方法

1.3.1 静电纺丝吸水垫的制备

配制纺丝溶液：首先称取1.5 g PVA粉末，加双蒸水定容至20 mL，85 ℃水浴加热20 min，搅拌至完全溶解配制成75 g/L的PVA溶液。然后加入PVA质量0、3%、6%、9%、12%的CA，配制成混合溶液。将0.3 g CO加入到PVA/9% CA混合溶液中，最终纺丝溶液中CO的含量为20%（以PVA质量计）。

静电纺丝吸水垫的制备：将所得纺丝溶液移至10 mL注射器中，静电纺丝吸水垫的制备采用电压调节直流电源，施加电压为15 kV，进样速率为0.24 mL/h，接收距离为12 cm。然后将收集得到的纳米纤维进行加热处理，加热条件为130 ℃、8 min，最终得到酯化交联的静电纺丝吸水垫。

图1 静电纺丝吸水垫制作流程图Fig. 1 Flow chart for the preparation of hygroscopic pads by electrospinning

1.3.2 静电纺丝吸水垫结构与性质测定

1.3.2.1 傅里叶变换红外光谱测定

采用傅里叶变换红外光谱仪测量纳米纤维的红外吸收光谱，光谱范围500～4 000 cm－1，扫描次数64。

1.3.2.2 溶胀率和溶胀损失率测定

溶胀率和溶胀损失率的测定采用Mayachiew[15]、Khoshgozaran-Abras[16]等的方法。首先将干燥至恒质量的样品剪成相同大小（3 cm×3 cm）并称量其质量（m0/mg），然后将样品置于30 mL的蒸馏水中浸泡24 h，测溶胀率时用滤纸将样品表面水分吸干后称量其质量（m1/mg）；测溶胀损失率时，将浸泡24 h的样品在105 ℃下烘干至恒质量（m2/mg）。溶胀率和溶胀损失率分别按公式（1）、（2）计算。

1.3.2.3 微观结构观察

采用扫描电子显微镜观察静电纺丝吸水垫的形貌结构，其中放大倍数为10k，加速电压为5 kV，工作距离为10 mm。观察吸水前的吸水垫样品时，样品不用进行前处理，观察吸水后吸水垫时需要预先将样品冻干处理。测定纳米纤维直径时首先选取平行样品的扫描电子显微镜照片，然后利用ImageJ软件对图像进行整体分析，纤维直径取各平行样品的平均值。采用透射电子显微镜观察包埋CO后的静电纺丝吸水垫形貌，加速电压为100 kV。

1.3.3 猪肉保鲜实验

1.3.3.1 原料处理

将购买的新鲜猪里脊肉切成相同大小的肉块（4 cm×4 cm×4 cm）分别放置于托盘包装盒中，设置3 组实验，空白组不使用吸水垫，无尘纸吸水垫组使用市售吸水垫，静电纺丝吸水垫组使用PVA/9% CA/20% CO的抑菌吸水垫。将样品置于4 ℃条件下贮藏，分别在冷藏过程中的第0、2、4、6、8、10天各取样一次，测定肉中菌落总数、pH值、TVB-N含量以及猪肉在贮藏过程中外观品质的变化。

1.3.3.2 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]进行测定。

1.3.3.3 pH值的测定

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[18]进行测定。

1.3.3.4 TVB-N含量的测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法[19]进行测定。

1.3.3.5 颜色测定

利用色差仪测定猪肉样品的亮度L*值、红绿度a*值和黄蓝度b*值。使用色差仪前，用配套黑板和白板进行校正。擦干肉样表面水分，并将其置于色差杯中进行样品测定。每个样品选取3个不同位置进行测定，重复测定3个样品，结果取平均值。并用相机在相同环境下对贮藏期内猪肉样品（单独的3 cm×3 cm×2 cm样品用于拍照）进行拍照记录。

1.3.3.6 电子鼻测定挥发性气味

准确称取6 g切碎后的样品置于顶空密封瓶中，室温下放置30 min使其顶部空间挥发性物质达到平衡状态，使用便携式电子鼻气味分析仪进行测定，每个样品进行3 次平行实验，每个处理重复3 次。

电子鼻检测参数：传感器自清洗时间100 s；传感器归零时间10 s；进样流量300 mL/min；分析测试时间90 s。电子鼻10 种传感器的性能描述见表1。

表1 PEN3电子鼻传感器敏感物质Table 1 PEN3 electronic nose sensors sensitive to various volatile substances

1.4 数据统计与分析

所有实验进行了3 次独立实验，结果表示为平均值±标准差。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包中的Linear Models程序进行，差异显著性分析使用Tukey HSD检验程序，P＜0.05表示差异显著。采用Sigmaplot 12.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 静电纺丝吸水垫的结构与性质

2.1.1 傅里叶变换红外光谱分析结果

图2为静电纺丝吸水垫的傅里叶变换红外光谱图。纯PVA纳米纤维的特征吸收峰分别为：3 384 cm-1（O—H伸缩振动）、2 940 cm-1（烷基C—H）、1 436 cm-1（CH2弯曲振动）和1 094 cm-1（C—O伸缩振动）。经3%、6%、9%、12% CA交联的纳米纤维在1 716 cm-1左右出现了新的COO—特征峰，并且随着CA添加量的增加，酯基的特征峰强度逐渐加强。这证明PVA的羟基与CA的羧基之间会发生酯化交联反应形成酯基。Kanatt等[20]利用CA交联羧甲基纤维素/PVA制备耐水性活性包装得到了相似的结果，他们发现随着CA浓度的增加，在1 734 cm-1处的酯基特征峰强度加强。

图2 静电纺丝吸水垫的傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of electrospun hygroscopic pads

2.1.2 溶胀率与溶胀损失率

吸水垫的溶胀能力反映了吸水垫的吸水能力[21]。表2显示了无尘纸吸水垫和静电纺丝吸水垫的溶胀率和溶胀损失率。未交联的静电纺丝吸水垫遇水后结构发生破坏，溶胀损失率达到100%，无法研究其溶胀率。交联静电纺丝吸水垫的溶胀率都在400%以上，显著高于无尘纸吸水垫的溶胀率（264%），说明其具有更高的吸水能力。这可能是因为它们的三维纳米结构更有利于水分子进入。此外，交联后静电纺丝吸水垫的溶胀率随CA添加量的增加而降低，这一现象可能是因为交联程度随CA添加量的增加而增大，进而使得吸水垫中亲水基团数量减少，导致静电纺丝吸水垫吸水能力下降。这与Zou Guoxiang等[22]的研究结果一致，他们在研究中提出淀粉膜的溶胀率随着交联剂添加量的增加而降低。

溶胀损失率是体现薄膜耐水性的一个重要指标。水溶性较低的包装膜可以在包装中保持自身的完整性，尤其适合应用在含水量较高的食品中。如表2所示，无尘纸吸水垫由于材料原因，几乎没有溶胀损失，而静电纺丝吸水垫溶胀损失率随着CA添加量的增加而降低，这是因为交联过程使得吸水垫的结构更稳定，从而使溶胀损失率降低。这与Shi Rui等[21]利用CA交联PVA/淀粉膜的研究结果一致。总结来看，在实际应用过程中要求活性食品包装具有更高的溶胀率和水稳定性，因此本研究选择了9% CA交联的静电纺丝吸水垫进行下一步实验。

表2 市售吸水垫和不同CA添加量的静电纺丝吸水垫的溶胀率和溶胀损失率Table 2 Comparison of swelling rates and swelling loss rates between commercial hygroscopic pads and electrospun hygroscopic pads with different citric acid contents

2.1.3 静电纺丝吸水垫的微观结构

从图3A可以看出，纳米纤维形态光滑均一，纤维呈无规则分布，这使得静电纺丝吸水垫具有高孔隙率以及高比表面积。从图3B可以看出，静电纺丝吸水垫吸水后呈现溶胀状态，纤维与纤维之间的孔隙率降低，但吸水垫结构完整，无破损情况。这也表明利用CA作为交联剂提高PVA的耐水性是一种切实可行的办法，同时与红外光谱结果相印证。从图3C可以看出，总体上纤维直径分布比较集中，100～150 nm的纤维比重最大，其次是150～200 nm。图3D是纳米纤维包埋CO后的透射电子显微镜图，可以看到在纤维中出现“囊泡”的结构，这说明CO被成功包埋到纳米纤维中。

图3 静电纺丝吸水垫的微观结构Fig. 3 Microstructure of electrospun hygroscopic pads

2.2 PVA/9% CA/20% CO的抑菌吸水垫对猪肉贮藏过程中的品质影响

2.2.1 菌落总数

研究表明，新鲜肉菌落总数低于4.0（lg（CFU/g）），次鲜肉菌落总数为4.0～6.0（lg（CFU/g）），变质肉菌落总数超过6.0（lg（CFU/g））[23]。由图4可知，在冷藏过程中空白组菌落总数的增长速度明显高于无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组。冷藏至第6天时，空白组中冷却猪肉菌落总数已超过了6.0（lg（CFU/g）），而无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组分别为5.55（lg（CFU/g））和5.13（lg（CFU/g）），显著低于空白组（P＜0.05）。随着冷藏时间的延长，无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组的菌落总数呈上升趋势，分别在第8天和第10天时，样品菌落总数超过6.0（lg（CFU/g））。在本研究中，空白组未经任何处理，冷鲜肉中流出的肉汁积聚在托盘内部，加速了微生物的繁殖，导致冷鲜肉腐败更快。相比于空白组，虽然无尘纸吸水垫可以提高托盘包装卫生条件，但保鲜效果不佳，可能是因为无尘纸吸水垫的吸水能力较低。在静电纺丝吸水垫组中，静电纺丝吸水垫吸收肉汁能力更强，并且当静电纺丝吸水垫发生溶胀时，可以释放出具有抑菌和抗氧化作用的CO至鲜肉表面[24-25]。二者的联合使用能增加吸水垫的保鲜能力，降低鲜肉中细菌的生长速率。故静电纺丝吸水垫的冷藏保鲜效果更加明显。

图4 不同吸水包装材料对冷藏过程中猪肉菌落总数的影响Fig. 4 Effects of different hygroscopic packaging materials on total viable count in chilled meat during storage

2.2.2 pH值

如图5所示，3 组猪肉样品的pH值随冷藏时间的延长均呈现先下降后上升的趋势。在第2天时3 组样品的pH值无显著性差异，说明9% CA和PVA完全酯化交联后，不会影响pH值，这与Kanatt等[20]的研究结果相似。在第4天和第6天时，静电纺丝吸水垫组的pH值显著低于空白组和无尘纸吸水垫组（P＜0.05）。到第10天时，空白组pH值和无尘纸吸水垫组pH值无显著差异（P＞0.05），但静电纺丝吸水垫组pH值仍显著低于空白组和无尘纸吸水垫组（P＜0.05）。3 组样品pH值在前期下降可能是因为宰后肌肉中的肌糖原经过糖酵解过程不断被分解，最终产生乳酸[26]。随着冷藏时间的延长，细菌大量繁殖产生的蛋白酶使蛋白质分解生成碱性的胺类等物质，从而使后期pH值不断上升[27]。

图5 不同吸水包装材料对冷藏期内冷鲜肉pH值的影响Fig. 5 Effects of different hygroscopic packaging materials on pH of chilled meat during storage

2.2.3 TVB-N含量

在酶和细菌的作用下，冷藏过程中肉的蛋白质被分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，这些物质被称为挥发性盐基氮[28]。因此，TVB-N含量可以作为评价肉类新鲜度的重要参考指标。如图6所示，3 组猪肉样品的TVB-N含量随冷藏时间的延长均呈现上升趋势。在同一冷藏时间，空白组TVB-N含量整体上显著高于无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组（P＜0.05）。依据GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》，鲜肉的TVB-N含量应不高于15 mg/100 g。在冷藏第8天时，空白组和无尘纸吸水垫组冷却肉的TVB-N含量已超过15 mg/100 g，并且在感官上有强烈的酸腐味道，而在冷藏第10天时，静电纺丝吸水垫组的TVB-N含量才刚达到15 mg/100 g。因此，静电纺丝吸水垫的吸水抑菌双重作用可以较好地减缓TVB-N生成速度，减缓蛋白质氧化。

图6 不同吸水包装材料对冷藏期内冷鲜肉TVB-N含量的影响Fig. 6 Effects of different hygroscopic packaging materials on TVB-N content in chilled meat during storage

2.2.4 色泽变化

鲜肉表面颜色是衡量鲜肉品质的重要指标。如表3所示，3 组样品L*值和a*值均随冷藏时间的延长而显著降低，b*值呈现缓慢上升的趋势。与空白组和无尘纸吸水垫组相比，静电纺丝吸水垫可以有效地降低L*值和a*值的下降速率。在冷藏过程中冷鲜肉颜色改变与血红蛋白氧化有关，细菌污染和脂肪氧化会导致鲜肉中血红蛋白逐渐被氧化为高铁肌红蛋白[29]。因此，包埋CO的静电纺丝吸水垫能有效抑制鲜肉中血红蛋白的氧化，从而延缓鲜肉色泽变化，提高其感官品质。

表3 冷鲜肉在冷藏过程中L*值、a*值和b*值的变化Table 3 Changes in color characteristics (L*, a* and b* values) of chilled meat during storage

猪肉在冷藏过程中的外观变化如图7所示。随着冷藏时间的延长，各组猪肉样品的颜色逐渐加深，并且空白组猪肉样品颜色加深的速度比无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组快，到第4天时，空白组和无尘纸吸水垫组猪肉样品表面开始发黏，汁液流失，颜色明显深于静电纺丝吸水垫组，而静电纺丝吸水垫到第6天仍能保持良好的感官品质。冷鲜肉外观变化与上述色差结果一致，这说明包埋CO的静电纺丝吸水垫在延长冷鲜猪肉货架期方面具有一定的应用前景。

图7 冷鲜肉在冷藏过程中的外观变化Fig. 7 Appearance changes of chilled meat during storage

2.2.5 挥发性气味

冷鲜肉腐败过程往往伴随着异味的产生，气味常被消费者用作鉴别冷鲜肉品质好坏的指标[30]。利用电子鼻技术可以检测冷鲜肉在冷藏期间产生的挥发性气味。图8显示，冷藏前2 d，3 组样品电子鼻10个传感器的响应值变化不大，说明冷鲜肉的挥发性气味物质产生较少；随着冷藏时间延长，空白组中传感器W1W、W6S、W5S和W1S的响应值逐渐增加，说明冷藏过程中产生了硫化物、氢化物、氮氧化合物和烷类物质，其中空白组冷鲜肉品质下降最为明显，尤其是W1S的响应值增加特别明显，第10天较第0天增加了625%，说明冷鲜肉冷藏过程中烷类是风味变化最明显的成分；冷藏至第6天时，静电纺丝吸水垫组中各传感器的响应值明显低于无尘纸吸水垫组和空白组，且上升速率较为平缓。由传感器W1W的响应值可以看出，静电纺丝吸水垫组可以降低硫化物的生成，说明抑菌吸水垫可以有效抑制挥发性气体的产生，对延缓冷鲜肉品质变化的作用最为明显。此外，挥发性气味物质变化规律与冷鲜肉TVB-N含量的变化趋势基本一致，即冷藏4 d后空白组和无尘纸吸水垫组指标值急剧增加，而静电纺丝吸水垫组增加相对平缓，保鲜效果较好。

图8 冷藏过程中冷鲜肉气味传感器响应雷达图Fig. 8 Radar map of sensor responses to chilled meat during cold storage

对电子鼻测定结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果如图9所示。PCA是借助矩阵运算，对高维变量空间进行降维处理，然后将测定对象进行线性分类，最终以第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的二维散点图形式将原始数据中的主要信息呈现出来的一种多元统计分析方法[31]。图9显示，空白组、无尘纸吸水垫组和静电纺丝吸水垫组的累计贡献率（PC1+PC2）分别为98.588%、96.479%和98.916%，说明2个主成分均可以较好地反映3 组样品的多指标信息。从图9可以看出，空白组和无尘纸吸水垫组第4天和第6天散点位置距第0天较远，说明气味差异较大；而静电纺丝吸水垫组样品的散点位置相距第0天相对较近，说明冷鲜肉保鲜后在冷藏过程中挥发性气味成分变化较小，品质较为稳定。

图9 冷藏过程中冷鲜肉气味电子鼻响应值的PCA图Fig. 9 Principal component analysis of electronic nose responses to the volatile flavor of chilled meat during cold storage

3 结 论

本实验基于静电纺丝技术利用CA热诱导交联的方式制备了具有高吸水性和抑菌性的静电纺丝吸水垫，静电纺丝吸水垫的溶胀率都在400%以上，显著高于无尘纸吸水垫，说明静电纺丝结合热诱导交联技术在制备食品吸水垫方面具有较大潜力。猪肉4 ℃保鲜实验结果表明，静电纺丝抑菌吸水垫可有效抑制冷鲜肉细菌生长和挥发性气味产生，延缓冷鲜肉TVB-N含量和pH值增加，显示其有一定的抗菌能力。同时，静电纺丝抑菌吸水垫对冷鲜肉具有良好的护色效果，可延缓冷鲜肉的氧化变色。因此，本实验制备的静电纺丝抑菌吸水垫可延长托盘包装冷鲜肉的货架期，同时不会对冷鲜肉的品质产生不良影响。