脱水香菇不同贮藏水分活度下细菌菌落演替规律及关键菌控制

苏安祥，浦浩亮，胡秋辉，徐 辉，刘建辉，谢旻皓，裴 斐，杨文建

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

香菇味道鲜美，营养丰富，富含多糖等生物活性成分[1]，具有细胞保护[2]、改善肥胖[3]、免疫调节[4]等多种功能，深受广大消费者的喜爱。香菇是我国产量最大的食用菌品种，据中国食用菌协会统计，2019年我国香菇产量1 115.94万 t，占所有食用菌总产量的28%。包括香菇在内的食用菌加工产品主要以脱水产品为主，2019年干货类食用菌创汇额23.08亿 美元，占食用菌出口创汇总金额的64%。香菇的脱水加工方式有热风干燥[5]、脉冲气体射流干燥[6]、微波干燥[7]、冷冻干燥[7]以及联合干燥[7]等方式，目前研究主要集中在脱水干燥工艺的优化[8]、脱水过程中营养成分及风味变化[9]等，脱水香菇在贮藏过程中的品质变化规律及控制技术研究鲜有报道。

目前，香菇的脱水工艺已相对成熟，但是脱水香菇易吸潮，贮藏期间产品水分的变化是影响脱水香菇品质的主要因素[10-11]。同时，在实际贮运过程中，贮藏条件良莠不齐，包装方式粗放简陋，仅采用普通塑料包装甚至无包装，这都会导致脱水香菇发生微生物超标、食用品质劣变等现象[12]。本课题组前期对脱水胡萝卜[13]、香葱[14]、双孢菇[15]等进行了贮藏期间品质分析研究，发现微生物污染会导致脱水蔬菜腐烂、产生不良气味以及引发食品安全问题，并且不同品种蔬菜贮藏期间微生物变化规律不同。因此研究不同水分活度（water activity，aw）环境下脱水香菇的细菌菌落变化规律，确定关键危害菌并寻找其控制方法，对通过开发新型包装、研究适宜贮藏技术来控制脱水香菇产品质量、延长货架期具有重要意义。

本实验研究不同aw环境下贮藏脱水香菇的细菌菌落变化，筛选影响脱水香菇卫生安全的主要危害菌，并针对关键菌进行电子束辐照控制，为脱水香菇的品质控制、货架期研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜香菇采购自福建漳州生产基地，经江苏兴化脱水食品集团脱水处理（热风干燥，温度60 ℃，风速3.5 m/s），获得最终水分质量分数为（11.57±0.01）%、aw为（0.33±0.03）的脱水香菇。

金黄色葡萄球菌 北京北纳创联生物技术研究院；C7～C33正构烷烃、二丙基二硫醚 Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；TIANamp细菌DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司（北京）；平板计数琼脂、乳酸、苯酚、核酸染色剂、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Tris、Tris-平衡酚、DNA聚合酶、dNTP mixture、电泳loading buffer等 阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

GNP9160型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司；SX500快速自动高压灭菌仪 日本TOMY Digital Biology公司；SF-CF-2A超净工作台 郑州南北仪器设备有限公司；VOSHIN-600R无菌均质机无锡沃信仪器有限公司；Power Pac Universal型电泳仪、Mini Protean 3 Cell小型电泳槽 美国Bio-Rad公司；ESS-010-03型电子直线加速器 日本IHI公司。

1.3 方法

1.3.1 样品贮藏条件设定

参考已报道的方法[16-17]配制K2CO3、NaNO2、NaCl和KCl 4 种饱和溶液，制备不同aw（0.43、0.67、0.76和0.84）环境，将配制好的4 种饱和盐溶液（200 mL）分别置于干燥器（220 mm口径）内，然后将80 g大小均一、新制备的热风干燥脱水香菇放入，用凡士林密封后置于25 ℃恒温恒湿箱贮藏50 d，每个aw设置3 组平行。

1.3.2 脱水香菇的细菌DNA提取及测序

参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》中的方法提取脱水香菇细菌的菌液。

提取0 d样品和不同aw环境下贮藏50 d样品的细菌DNA（共5 组样本），每组样本取3个平行。使用上述菌液，采用细菌DNA试剂盒提取脱水香菇细菌总DNA。将提取的DNA样本放入冻存管中密封，在V3～V4区域，利用聚合酶链式反应扩增细菌DNA序列（上游引物序列：341F 5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；下游引物序列：805R 5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），采用Illumina MiSeq平台进行测序[18]。

1.3.3 脱水香菇的细菌DNA序列数据处理

细菌DNA序列的数据分析通过如下步骤完成：

第一，对测序数据进行预处理，使用FLASH软件得到拼接的序列，利用Usearch过滤去除非特异性扩增片段，从而得到有效序列[19]。

第二，利用UPARSE软件（v7.0.1001）将过滤后的序列以97%相似性聚类，从而得到操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），并进行随机抽取[20]。使用Mothur软件，比对ribosomal database project（RDP）数据库，标注OTU表的种属信息，并统计样本在生物分类学各分类水平下的物种组成和相对丰度[21]。基于RDP数据库，利用Mothur软件进行80%置信水平的分类学分配[22]。序列过滤的主要步骤是：1）选择含有条形码和正向引物的序列，并消除具有单个碱基对的序列；2）去除短于150 bp的序列、含不明确的碱基对或者引物中有两个以上错误匹配的序列；3）条形码和正向引物的消除。使用Mothur软件将有效序列聚集到不同物种水平的OTU[23]。

1.3.4 金黄色葡萄球菌侵染脱水香菇

将109CFU/mL金黄色葡萄球菌菌悬液按照质量比1∶10的比例均匀接种到脱水香菇中[24]，室温下风干18～24 h，控制水分质量分数保持在10%左右用于杀菌实验，测得香菇中微生物含量为5.6×108CFU/g，相当于8.7（lg（CFU/g））。将80 g均匀接种后的脱水香菇装入无菌塑料自封袋中，密封后进行辐照。

1.3.5 电子束辐照处理金黄色葡萄球菌侵染后的脱水香菇

采用ESS-010-03电子直线加速器对脱水香菇进行辐照处理。设备具体参数如下：额定能量10 MeV，功率11.7 kW，重复可变频率5～50 pps，扫描电流9.8 A，扫描高度520 mm，不均匀度小于5%。将装有脱水香菇的无菌塑料自封袋密封后用于电子束辐照，辐照剂量分别控制在1、2、3、4、5 kGy，样品采用半吸收剂量、翻转180°的辐照方式，以保证样品吸收剂量均匀。每个剂量水平重复5 次。

1.3.6 金黄色葡萄球菌菌落计数

金黄色葡萄球菌总数参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》方法进行菌落计数。

1.4 数据处理与分析

数据结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计分析，使用单因素方差分析（oneway analysis of variance）的最小显著性差异法（least significant differences，LSDs）对数据进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。使用MURTHOR、R和Lefse软件进行Alpha、Beta多样性分析。

2 结果与分析

2.1 不同aw环境对脱水香菇细菌的α多样性影响

稀释曲线用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。图1A中，样品的细菌DNA稀释曲线随着抽取Reads数增加而趋于平稳，说明测序深度已经覆盖到脱水香菇细菌的所有物种，测序数据量合理。Shannon稀释曲线用来评价测序量是否足够，并间接反映样品中物种的丰富程度。由图1B、C可知，0 d样品的Alpha多样性丰富程度最低，aw=0.43、0.67、0.76和0.84环境下样品的Shannon指数远高于0 d，并且随着aw增加而上升。Simpson指数用来描述从一个群落中连续两次抽样所得到的个体数属于同一种的概率[25]。图1D中可以看出，Simpson指数随着aw上升而降低，说明样品细菌的多样性增加。以上结果表明，脱水香菇贮藏期间细菌的多样性随着环境aw上升而增加。

2.2 不同aw环境对脱水香菇细菌的β多样性影响

样品聚类分析可以从整体上描述样品间的相似性，相似度越高的样品越会被优先聚类。不同处理样品的聚类分析如图2A所示，贮藏50 d后，aw=0.43与aw=0.67环境下的样品细菌组成相似度高于0 d样品和aw=0.84组样品。主成分分析（principal component analysis，PCA）结果（图2B）显示，0 d样品的信号值位于第二象限，但随着aw的上升，各个样品的信号值从左向右移动，且aw值越高，其在PCA图中距离0 d样品最远。说明环境aw越高，脱水香菇细菌组成在贮藏过程中变化越大，这与图2A所示结果一致。

以上结果说明高aw环境促进了脱水香菇细菌的生长，并且细菌多样性随着环境aw升高而增加。

2.3 不同aw环境对脱水香菇细菌科水平组成的影响

热图可以对物种和样本分别进行聚类，并且热图中可展示每个样本的细菌组成，越相似的样品在聚类树上的距离越近。这种分析方法能够直观地反映出所有样本在特定生物水平上物种组成的相似性，并且还可以显示某些菌群分布的特异性。由图3可知，在科水平上，0 d样品主要优势细菌为肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）以及明串珠菌科（Leuconostocaceae），其中肠杆菌科的相对丰度达到50%。以上4 种细菌广泛存在于自然界中，其中链球菌科和明串珠菌科均属于乳杆菌目（Lactobacillales）。该目微生物可以利用消耗植物基质中的营养成分进行生长代谢，可造成多种食品的腐败[26]。贮藏50 d后，肠杆菌科的相对丰度随着环境aw的升高而降低，在aw=0.84的样品中仅达到3%左右。链球菌科和明串珠菌科相对丰度出现了类似的下降趋势。然而葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的相对丰度随着环境aw增加而上升，这是由于高aw环境中更利于这两个科的细菌生长繁殖[27]。这两个科的菌株在生长过程中会产生有害代谢物（如生物胺和肠毒素等），能够导致多种食源性疾病[27]。

图3中聚类分析结果表明，在aw=0.43和aw=0.67环境下贮藏脱水香菇细菌菌相的相似度较高，首先被聚类到一起，之后与aw=0.76样品聚类，接着与aw=0.84的样品聚类，最后与0 d样品聚类。

2.4 不同aw环境对脱水香菇细菌属水平组成的影响

图4A为脱水香菇在属水平上的细菌菌落组成。在贮藏过程中，不同aw环境属水平上的菌相发生明显变化。0 d样品，优势菌属为爱文氏菌属（Ewingellaspp.）、乳球菌属（Lactococcusspp.）、魏斯氏菌属（Weissellaspp.）和假单胞菌属（Pseudomonasspp.），其中爱文氏菌属的相对丰度最高，达到（34.63±2.09）%，乳球菌属达到（22.00±2.43）%。这些细菌是食用菌生产加工过程中常见的细菌，对香菇的品质有重要影响，例如，假单胞菌属是导致双孢蘑菇和香菇等食用菌类农产品采后腐败的优势腐败微生物[28]，爱文氏菌属中的部分菌株可以引起双孢蘑菇、香菇等常见菇类一种“内柄坏死”的褐变现象[29]。

由图4B可知，贮藏50 d后，魏斯氏菌属、乳球菌属相对丰度下降至5%以下，aw=0.84处理组爱文氏菌属的相对含量从初始的（34.63±2.09）%降到（0.51±0.14）%。考克氏菌属（Kocuriaspp.）、短状杆菌属（Brachybacteriumspp.）、芽孢杆菌属（Bacillusspp.）、葡萄球菌属（Staphylococcusspp.）相对丰度随环境aw增加而上升，而假单胞菌属随着环境aw增加呈现出先上升后下降的趋势。其中考克氏菌属、短状杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属都属于革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，可达20～80 nm。相对于革兰氏阴性菌假单胞菌，革兰氏阳性菌机械抗性与对干燥的抗性更高，在脱水干燥加工过程中更易存活[30]。此外，部分魏斯菌属可分泌具有抑菌活性的多肽，这类多肽具有抑制腐败微生物和致病菌生长的能力[31]。魏斯氏菌属相对丰度降低可能给其他细菌生长提供了条件。葡萄球菌属中的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起细菌性食物中毒的重要致病菌之一，广泛存在于自然环境中，对各种理化因素都有较高的抵抗力，常在干制品中存在并导致食源性疾病[32]。

图4 脱水香菇在属水平上的细菌组成和主要细菌的相对丰度变化Fig. 4 Bacteria composition in dried Lentinus edodes at the genus level and relative abundance of major genera

2.5 脱水香菇贮藏过程中关键危害菌的筛选

采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应量（LDA effect size，LEfSe）方法，以|LDA|＞2且P＜0.05作为差异筛选阈值，用于筛选最可能解释组间差异的物种。

图5A为LEfSe进化分支图，筛选出各组中组间丰度显著差异（P＜0.05）的物种，每层物种标记的注释从外向内表示门、纲、目、科、属和种。对LEfSe进化分支图中的物种进一步筛选得到|LDA|＞2的物种，即为组间丰度显著差异的物种，得到图5B。由图5A、B可知，在细菌的科水平上组间丰度显著差异的物种从数量上总体随着环境aw增大而增多。0 d样品和aw=0.43、0.67和0.76样品的显著差异物种数目分别为5、4、8、10个。此外，与0 d样品相比，在科水平上，aw=0.84环境下的样品有24个科的细菌的相对丰度具有显著差异。这些科的细菌包括红杆菌科（Rhodobacteraceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）等。而在属水平上，与0 d相比，aw=0.84贮藏的样品有20个菌属的丰度具有显著差异，其中包括考克氏菌属（Kocuriaspp.）、节杆菌属（Arthrobacterspp.）、片红球菌属（Rhodococcusspp.）、葡萄球菌属（Staphylococcusspp.）、副球菌属（Paracoccusspp.）和链球菌属（Streptococcusspp.）。

图5 组间线性判别分析效应量分析结果Fig. 5 Effect-size analysis of linear discriminant analysis between groups

综合考虑脱水香菇贮藏过程中细菌变化情况及其对食品安全的危害风险，选定金黄色葡萄球菌作为关键危害菌进行下一步控制技术研究。

2.6 电子束辐照对脱水香菇中金黄色葡萄球菌的控制效果

采用杀菌前后微生物减少数量的对数来评价电子束辐照对于金黄色葡萄球菌的杀菌效果。从图6可以看出不同剂量的电子束辐照对于脱水香菇上金黄色葡萄球菌杀灭效果的影响，总体上呈现辐照剂量越高，杀菌效果越好的现象。1、4 kGy辐照处理侵染样品的金黄色葡萄球菌数降低了4.4（lg（CFU/g）），而经过4 kGy处理样品金黄色葡萄球菌数降低超过6（lg（CFU/g）），5 kGy则可以几乎杀死全部金黄色葡萄球菌。文献报道了其他学者采用电子束辐照技术控制金黄色葡萄球菌的效果，王海宏等[33]研究了速冻芦笋的电子束检疫杀菌和辐照工艺，接种到速冻芦笋之后，1.5 kGy的剂量可以使金黄色葡萄球菌数降低4.39（lg（CFU/g））；岳玲等[34]研究了电子束辐照对冷鲜鸡肉的杀菌效果，根据回归方程计算得出1 kGy的电子束辐照使金黄色葡萄球菌数降低4（lg（CFU/g））；Kim等[35]的研究结果表明剂量在3 kGy电子束辐照可以使披萨芝士中的金黄色葡萄球菌降低5.14（lg（CFU/g））。以上结果表明电子束辐照可以有效控制金黄色葡萄球菌，根据GB/T 18525.5—2001《干香菇辐照杀虫防霉工艺》中规定，干香菇辐照杀虫工艺剂量为0.7～2.0 kGy，防霉工艺剂量为3～5 kGy，不影响香菇品质的最高耐受剂量为8 kGy，结合本实验结果可知，采用5 kGy剂量的电子束辐照可以有效杀灭脱水香菇中金黄色葡萄球菌，且在最高耐受剂量范围内，符合国家标准。

图6 电子束辐照杀菌效果Fig. 6 Killing effect of electron beam irradiation on Staphylococcus aureus in dried Lentinus edodes

3 结 论

本实验研究了不同aw环境下脱水香菇贮藏期间的细菌菌落变化规律，发现脱水香菇贮藏初期主要菌为肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）和明串珠菌科（Leuconostocaceae），其中肠杆菌科的相对丰度达到50%左右。贮藏50 d后，肠杆菌科的相对丰度明显降低，在aw=0.84的样品中仅有3%，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的相对丰度上升，其中葡萄球菌是脱水香菇贮藏期间需要重点控制的关键菌。本实验以金黄色葡萄球菌侵染脱水香菇，通过电子束辐照研究了脱水香菇产品微生物污染控制方法，发现5 kGy剂量的电子束辐照可以杀灭脱水香菇中几乎全部金黄色葡萄球菌，且在最高耐受剂量范围内，符合国家标准。