微波法制备莲子淀粉-绿原酸复合物及其流变特性分析

王健一，汤俊杰，江祥富，郭泽镔，郑宝东,*，张 怡,*

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室，福建 福州 350002）

淀粉作为植物性食物的重要组成部分，是人类膳食中最主要的碳水化合物来源。相较于一般天然高分子聚合物，淀粉具有独特的胶体性能，在适宜条件下能增加流体或半流体体系的黏度并形成凝胶。因此，除了食品领域，淀粉在材料化工领域也得到广泛的应用[1]。但天然淀粉由于易老化、溶解性低、剪切稳定性和热稳定性差等缺点限制了它在工业中的应用范围。长期以来，对原淀粉经过特定的化学、物理或生物改性处理使其符合不同加工需求是拓宽淀粉功能特性的主要方式[2]。随着科学技术的发展，国内外学者已成功通过多种改性手段实现了淀粉的不同领域应用。不同于传统的加热方式，微波是一种基于介电效应的多物理场现象（高频交变磁场产生的非电离辐射使物料内有极分子发生振荡及摩擦，由此引发的能量转化），具有启动时间短、穿透性强、能量效率高等优点，因此微波作为一种高效的加工方式被广泛应用于淀粉基食品的加工与生产[3-4]。研究发现，微波处理会引起淀粉分子之间发生剧烈的碰撞，导致淀粉颗粒内部晶区和非晶区结构单元重新排列，进而重塑淀粉大分子链段间的相互作用形式，改变其理化性质，如糊化特性、膨胀力和热稳定性等[5-7]。然而在淀粉基食物中，除淀粉外，其他小分子物质在整个食物的加工过程中同样起着不可忽视的作用，如酚类化合物[8]。此类化合物具有高活性的羟基基团，这些基团与淀粉的羟基相互作用可形成氢键，能直接或间接干预淀粉聚合物链的排列，阻碍淀粉螺旋结构的重组，是影响淀粉多尺度结构的重要因素[9-10]。

流变学是研究物质变形及流动规律的科学，它是力学的一个新分支。早在20世纪上半叶，学术界和工业界就开始尝试将食品大分子结构与其流变特性相关联。当前，借助流变学指导食品成型加工领域已经得到长足的进步。在淀粉基食品加工领域，研究淀粉体系的流变特性对建立淀粉结构（颗粒形貌、淀粉链结构、超分子构象等）与流体行为之间的关系，以及将理化参数与其在特定工业应用中的适用性相匹配是非常必要的[11-12]。综上，流变特性的研究已然成为淀粉基食品加工设计的重要组成部分。

莲子为睡莲科植物莲（Nelumbo nubiferaGaertn.）的成熟种子，是我国重要的特产经济作物，属于典型的高淀粉质食品，其淀粉质量分数高达60%，并含有丰富的酚类物质（绿原酸为其主要酚类物质，相对含量为66%）[13-14]。本团队前期研究发现，微波处理可以加速莲子淀粉内部氢键的破坏，从而大幅增加淀粉分子与其他客体分子间的作用位点，提示微波处理具有促进莲子淀粉复合物形成的作用[15-16]。目前鲜有关于微波处理对淀粉-多酚复杂体系流变特性的研究。因此，本实验通过微波法制备莲子淀粉-绿原酸复合物，研究微波处理对淀粉-多酚体系流变特性的影响，以期为微波在多元淀粉基食品加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻鲜莲由绿田（福建）食品有限公司提供。

绿原酸 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-200型高速组织捣碎机 常州翔天实验仪器厂；XH-300B微波萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；快速黏度分析（rapid visco analyze，RVA）仪 北京中西远大科技有限公司；MCR301型流变仪 奥地利安东帕公司；GPC-MALS凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统美国怀雅特技术公司；H1850R冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莲子淀粉-绿原酸复合物的制备

参照Wang Jianyi等[16]的方法制备莲子淀粉和莲子淀粉-绿原酸复合物。以蒸馏水为溶剂配制8 g/100 mL莲子淀粉、莲子淀粉-绿原酸复合物悬浮液。进一步将莲子淀粉及莲子淀粉-绿原酸混合溶液置于XH-300B微波萃取仪，用不同微波功率（200、250、300 W，8 min）对体系进行预处理。微波处理后离心（3 500×g，10 min），所得沉淀用体积分数50%乙醇溶液清洗，冷冻干燥并过筛（150 目）制得样品。莲子淀粉样品记为LS（LS-200、LS-250、LS-300分别表示经200、250、300 W微波处理LS的样品），莲子淀粉-绿原酸复合物样品记为LS-CA（LS-CA-200、LS-CA-250、LS-CA-300分别表示经200、250、300 W微波处理的LS-CA样品）。

1.3.2 糊化特性的测定

参考Guo Zebin等[17]的方法并稍作修改。准确称取2 g样品与25 mL蒸馏水混合，采用RVA仪测定莲子淀粉及莲子淀粉-绿原酸复合物的糊化特性。测试条件：50 ℃平衡1 min，以9 ℃/min速率升温至95 ℃，95 ℃恒温保持10 min后，以9 ℃/min速率降至50 ℃并保持2 min。

1.3.3 直链淀粉溶出量的测定

参考Li Min等[18]的方法并稍作修改。取20 mg淀粉样品溶于10 mL的蒸馏水中，3 500×g离心10 min，随后用碘结合法测定上清液中的直链淀粉含量，结果以每克淀粉所含直链淀粉质量表示，单位为mg/g。

1.3.4 流变特性的测定

取少量RVA糊化后的样品加载至下板中用于流变特性的测定，控制转子下压并除去多余样品。测试均采用CP-50锥形板（50 mm直径和1 mm狭缝），板间温度均为25 ℃，测试过程中为避免样品水分流失，用硅油将锥形板周围密封。

1.3.4.1 稳态剪切速率扫描

参考Shafiei-Sabet等[19]所描述的方法并稍作修改，采用对数取点的方式从0.001～100 s－1进行速率扫描，记录样品的稳态剪切黏度。

1.3.4.2 触变性测定

记录样品剪切应力（τ）随剪切速率（γ）在上升（0.1～500 s－1，上行线）及下降（500～0.1 s－1，下行线）过程中的变化，采用Herschel-Bulkley模型（下式）对流变曲线进行拟合分析。

式中：τ代表剪切应力/Pa；τ0代表屈服应力/Pa；γ代表剪切速率/s－1；K代表稠度系数/（Pa·sn）；n代表流体指数。

1.3.4.3 动态频率扫描

在应变为0.5%的条件下进行频率扫描（线性黏弹区内），角频率范围1～100 rad/s，记录扫描过程中储能模量（G’）及损耗模量（G’’）的变化。

1.3.5 复合物分子质量的测定

参考Zhang Yanjun等[20]的方法略有改动。称取5 mg样品溶解于10 mL二甲基亚砜-LiBr（50 mmol/L）溶液中，60 ℃加热搅拌8 h，然后10 000×g离心10 min，取上清液过0.45 μm膜待测。

凝胶色谱-示差-多角度激光光散射条件：色谱柱为Styragel HMW 6E柱；流速0.5 mL/min；测试温度65 ℃；进样量100 μL。

1.4 数据统计分析

应用SPSS 17.0和Origin Pro 7.5软件进行数据处理，采用Duncan新复极差法进行显著性分析。实验结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物RVA糊化曲线分析结果

天然淀粉颗粒具有致密的壳层结构，对水分子的渗透具有一定的阻碍作用，因此淀粉主要是以悬浮颗粒的形态分散在水相中。当淀粉颗粒在水中加热时，随着温度的升高，处于淀粉壳层内部的结构单元开始瓦解，晶体结构逐渐消失。在这个过程中淀粉颗粒吸水膨胀，分布于颗粒内部的直链淀粉逐步溶解，从而导致整个淀粉体系的黏度增大，溶液呈现糊状。由图1和表1可知，与原淀粉相比，莲子淀粉体系经过200～250 W微波处理8 min后，淀粉溶液的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度和回生值相对原淀粉均有不同程度的下降，但糊化温度却有所升高，且随微波功率增加逐渐升高。这是因为在微波处理过程中，淀粉内部的链结构会发生一定程度的降解，导致体系在糊化过程中无法形成稳定的缠结网络，表现出较低的糊化特性。然而在较低的微波功率下，淀粉链的降解程度是有限的，此时淀粉颗粒内部稳定性相对较差的缺陷结晶结构优先发生崩解，而稳定性较好的结晶结构却得到了强化，使得淀粉颗粒整体有序化程度反而增加，因此糊化温度升高[7,21]。这也与本课题组前期对莲子淀粉颗粒结构的研究结果[16]相一致，表明低功率的微波处理（200～250 W、8 min）无法完全破坏淀粉的壳层结构。随着微波功率继续增大（300 W、8 min），淀粉分子簇状结构将无法维持颗粒进一步膨胀，原有的壳层结构发生分解。从LS-300的糊化曲线可知，由于失去颗粒结构，淀粉体系仅在加热初期就开始吸水膨胀（黏度上升），其糊化温度从78.15 ℃降至51.62 ℃，但在膨胀糊化后，淀粉溶液的黏度与回生值却突然开始大幅度增加。研究发现，淀粉颗粒在低剪切力的情况下加热至糊化温度时，它们会膨胀并释放出一些分子质量较小的成分（主要为直链淀粉和一些分子质量较低的支链淀粉），其残留的颗粒组分会形成一种所谓“starch ghost”的特殊结构，此时溶出的直链淀粉将会和体系中的长支链淀粉相互交联，形成聚合物外壳覆盖在“starch ghost”的表面[22-24]。对于LS-300，高功率微波处理将促使部分直链淀粉提前溶出，形成更加稳定的直链淀粉外壳结构，造成淀粉溶液黏度骤然增大。LS-CA复合物样品的糊化特性整体低于LS样品，这是由于绿原酸的引入稀释了淀粉基质的浓度，使淀粉分子间的接触几率降低，减少了淀粉链糊化后的缠结与交联。此外，由于部分淀粉分子已经与绿原酸形成复合体，导致在加热过程体系中淀粉非晶态链的迁移率受限，进一步阻碍淀粉分子间的相互作用[25-26]。因此，即使在高功率微波组（LS-CA-300），莲子淀粉-绿原酸体系依然具有较低的黏度，表现出更佳的热稳定性与抗老化特性。

表1 不同微波功率下LS和LS-CA的糊化特性参数Table 1 Pasting characteristics of LS and LS-CA treated with different microwave powers

图1 不同微波功率下LS和LS-CA的RVA糊化曲线Fig. 1 Rapid visco analyze profiles of LS and LS-CA treated with different microwave powers

2.2 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物直链淀粉溶出分析结果

由图2可知，所有样品组中原淀粉的直链淀粉溶出量最低，这是因为直链淀粉分子是参与淀粉内部片层结构（尤其是无定形层）组装的重要成分[27]，由于天然淀粉具有致密的片层结构，导致大部分直链淀粉不能与碘直接接触，意味着位于颗粒内部片层区的直链淀粉无法被检测到。随着微波功率的提高，LS组的直链淀粉溶出量逐渐增大，表明此时淀粉颗粒的片层结构已经发生破坏，原先处于片层区内部的直链淀粉逐步溶出。值得注意的是，原淀粉中小部分直链淀粉分子可以与脂质形成V型复合物，即使在糊化条件下，这些直链淀粉-脂质复合物依然能维持其单螺旋结构的完整性，使其无法完全溶出[8]。与单一莲子淀粉LS样品相比，莲子淀粉-绿原酸复合物LS-CA样品的直链淀粉溶出量在相同微波功率下呈现不同程度的下降，且在300 W时最为明显。这些变化是由于在含有固定数量的直链淀粉体系中，绿原酸分子与碘分子之间存在竞争机制，即在微波处理过程中部分溶出的直链淀粉已经与绿原酸形成复合体，无法与碘发生显色反应，而在高功率微波组（300 W），大量直链淀粉的溶出为绿原酸分子提供更多作用位点，此时参与复合体形成的直链淀粉比例增大，导致LS-300与LS-CA-300之间表现出显著差异（P＜0.05）。这与2.1节RVA糊化曲线的变化趋势一致，证明绿原酸的存在抑制了糊化过程中直链淀粉的缠结与交联，从而使淀粉溶液的黏度降低。

图2 不同微波功率下LS和LS-CA的直链淀粉溶出量Fig. 2 Amounts of leached amylose from LS and LS-CA treated with different microwave powers

2.3 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物稳态剪切速率扫描分析结果

从图3中可以看出，伴随着剪切速率的增加，样品黏度的变化趋势可以划分为3个阶段（剪切变稀-剪切平台-剪切变稀）。研究表明，溶致性液晶聚合物体系具有3 段剪切黏度行为：在剪切速率增大的初期，手性向列相液晶结构域的排列导致体系的表观黏度呈现出减小的趋势；在中等剪切速率条件下，液晶结构域的取向逐渐与剪切方向相一致，溶液呈现出类牛顿流体行为；随着剪切速率的进一步升高，体系中所产生的剪切应力增大到足以破坏液晶结构域，此时液晶原沿剪切力的方向重新取向，流层间的阻力变小，溶液表观黏度明显下降[19]。对于淀粉分子而言，其支链淀粉的结构单元与侧链液晶聚合物具有高度相似性[28-29]，因此表现出类似于液晶体系的3 段剪切黏度行为。当剪切速率小于5.0×10－2s－1时，莲子淀粉体系的黏度均随着剪切速率的减小而迅速增大，说明莲子淀粉体系在低剪切速率下具有一定的劲度。一般而言，淀粉糊溶液的流动单元不是整个分子长链，而是淀粉链段之间的分段跃迁，通过链段相继拉伸，淀粉链的重心沿外力的方向偏移，从而实现流动[30]。而淀粉链之间通过相互缠绕形成一种拟网状凝胶结构，在静止状态下具有一定的韧性[31]，若剪切速率较小，淀粉链的流动将会异常困难，此时淀粉体系呈现类橡胶状，存在屈服前区的现象，说明莲子淀粉溶液是具有一定屈服应力的非牛顿流体。

图3 不同微波功率下LS和LS-CA的剪切流动曲线Fig. 3 Shear flow curves of LS and LS-CA treated with different microwave powers

通过对不同微波功率下莲子淀粉及莲子淀粉-绿原酸复合物流动曲线的分析可以看出，随着微波功率的升高，淀粉体系的3 段剪切黏度行为逐渐消失。这是因为淀粉糊体系的液晶特性主要依赖于支链淀粉侧链的构造单元（由双螺旋所形成的簇状结构），在此模型中，构造单元充当液晶原，经由簇间链段附着在淀粉主链上[32]。在微波作用后，部分构造单元会从淀粉主链上解耦分离，导致体系不再具备液晶行为[33]。另一方面，在这个过程中，更多的直链淀粉将参与溶液中连续相的构成，导致淀粉糊整体的刚性和劲度升高，意味着在流动取向的过程中不易恢复原形（具有更长的变形松弛时间）[34]，因此相对于低功率微波组，LS-300在较低的剪切速率下就进入剪切黏度行为的第3阶段，同时表现出更加明显的剪切稀化行为。通过对比可以发现，LS-CA组中的淀粉体系黏度整体低于LS组，这是因为绿原酸的添加将提高溶液的电导率，导致体系具有更高的介电损耗因子ε”（物体将微波能转化为热能的系数）[4]。因此相较于单一淀粉溶液，双元体系中的淀粉单元更易受到微波的影响；此外，当形成复合体后，绿原酸分子能够通过与直链淀粉相互作用减少淀粉链段的缠结，进一步弱化体系缠结区。此结果与RVA糊化曲线及直链淀粉溶出量的变化趋势一致，表明绿原酸的分子行为对淀粉糊的流变特性有着重要的影响。

2.4 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物触变行为分析结果

不同微波条件下莲子淀粉-绿原酸复合物的触变行为如图4所示，所有淀粉凝胶均呈现顺时针滞后环，说明莲子淀粉糊体系具有明显的触变性。研究表明，柔性链高分子物质在溶液中通常处于无规卷曲状态，此时分子链为自由联结的Gauss链构象，当体系在外力的作用下发生流动时，分子链被迫发生相对位移，导致联结点数量减少，体系黏度下降[35]。而淀粉大分子链的运动具备松弛特性，当外力消失后，发生改变的链构象会自发地产生弹性回复（熵弹性），但长链大分子的松弛时间较长，导致链构象无法及时恢复到平衡状态，因此会产生滞后环。为了进一步研究剪切力对莲子淀粉-绿原酸复合物触变行为的影响，本实验采用Herschel-Bulkley方程对其触变行为进行拟合，结果见表2。可以看出，随着微波功率的升高，莲子淀粉体系黏稠系数K与滞后环面积均呈现先减少后增大的趋势，而流体指数n则呈现相反的变化。这是因为一定范围内的微波处理（200～250 W）能够破坏淀粉分子链的完整性，导致淀粉糊体系中产生许多分子质量较小的碎片单元[4]，这些碎片结构能充当软化剂促使淀粉糊体系逐渐向牛顿流体转变，而300 W微波处理能够引起大量直链淀粉提前溶出形成长且稳定的缠结区强化淀粉糊凝胶网络，使体系呈明显的假塑性状态。该拟合结果与上述速率曲线的变化趋势相一致，证实直链淀粉的溶出会影响淀粉糊体系的慢松弛行为。进一步研究发现，当绿原酸加入淀粉体系后，所有微波处理组的触变性（滞后环面积）和黏稠系数都显著减小（P＜0.05），说明此时体系内淀粉分子链之间的作用力减弱，所形成的自由联结链构象具有更强的恢复性。这个结果表明莲子淀粉-绿原酸复合物的形成可以用于缓解淀粉糊体系在剪切过程中链构象单元的破坏，增强剪切抵抗力。

图4 不同微波功率下LS和LS-CA的触变行为Fig. 4 Thixotropic behavior of LS and LS-CA treated with different microwave power

表2 不同微波功率下LS和LS-CA流变曲线的Herschel-Bulkley模型拟合参数Table 2 Herschel-Bulkley rheological parameters of LS and LS-CA treated with different microwave powers

2.5 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物动态频率扫描分析结果

图5为不同微波条件下莲子淀粉及莲子淀粉-绿原酸复合物体系的动态模量变化曲线。可以看出，在整个角频率范围内（1～100 rad/s），所有样品的G’均高于G’’，且呈现出明显的频率依赖性，说明此时淀粉分子之间形成三维网络结构，表现出典型的弱凝胶黏弹性行为[36]。当淀粉经过微波处理后，淀粉糊的G’和G’’明显降低，表明微波处理弱化了淀粉糊的凝胶结构。这是因为微波会导致淀粉长链断裂及重排，使得淀粉凝胶体系中的长链淀粉分子所占的比例减少，而长链淀粉分子是维持凝胶永久缠结区稳定性的重要组分，故微波处理后淀粉糊体系的凝胶强度降低。但是当微波功率达到300 W后，淀粉颗粒完全破碎，大量直链淀粉提前溶出，这些溶出的直链淀粉能形成骨架结构强化缠结区，使得淀粉糊体系凝胶强度反而升高。这与RVA糊化曲线的结果相一致。对于复合组的淀粉凝胶来说，绿原酸的添加明显降低其G’和G’’，且在相同的微波功率下G’的变化大于G’’，说明绿原酸的加入对凝胶体系的弹性部分有更大影响。一般来说，在糊化过程中单一淀粉糊溶液能够形成以直链淀粉为连续相和以残留颗粒组分（“starch ghost”，主要是支链淀粉）为分散相的双相分散体系[24]，对于LS-CA复合物，其凝胶结构将更为复杂：一方面，部分物理包埋的绿原酸在高温条件下易发生降解并成为游离组分，在冷却过程中这些游离的组分将参与凝胶网络的组成，形成少量临时缠结区，相应的以淀粉分子为主的成胶交联结构数量减少，导致G’随复合程度的增大而减小；另一方面，部分绿原酸与淀粉形成复合体，使淀粉分子间将产生额外的空间位阻，阻碍淀粉凝胶网络的生成。基于此，认为绿原酸对淀粉凝胶体系弹性部分的影响主要是通过干预体系中直链淀粉分子的相互作用，进而减少凝胶网络中永久缠结区的形成。

图5 不同微波功率下LS和LS-CA的黏弹特性Fig. 5 Viscoelastic properties of LS and LS-CA treated with different microwave powers

2.6 不同微波功率下淀粉-绿原酸复合物分子质量分析结果

为进一步验证上述研究结论，采用凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统对体系分子质量进行测定，结果见表3。随着微波功率的升高，LS与LS-CA组的重均分子质量（mw）均呈下降的趋势，同时，在相同的微波条件下LS-CA组的下降程度更为明显，仅在200 W微波条件下其重均分子质量就已经降至6.44×106Da（减小了48%）。说明微波处理能够导致淀粉分子链结构发生断裂，其断裂程度取决于微波功率，当体系加入绿原酸后，淀粉组分的微波耐受性大幅度减弱，造成复合组的重均分子质量下降更为明显；相应的，由于体系中存在许多碎片链结构单元，导致LS与LS-CA组的多分散系数（mw/mn）分别从1.67及2.77（200 W）增至4.47及4.64（300 W），这与Yang Qingyu等[37]的研究结果相一致。

表3 不同微波功率下LS和LS-CA的分子质量分布Table 3 Molecular mass distribution of LS and LS-CA treated with different microwave powers

Z均旋转半径（Rz）可以用来表征淀粉体系分支程度的变化[38]，微波处理后的莲子淀粉及莲子淀粉-绿原酸复合体系的Z均旋转半径均小于天然淀粉样品，这与重均分子质量的变化趋势相一致，表明微波处理导致淀粉体系整体分支度降低，此时部分长链支链淀粉将会降解成短链结构单元。一般而言，在多糖聚合物体系中，分子质量越小其黏度也相应越低[39]，而在上述研究中LS-300组的黏度反而会出现显著的上升现象，这是因为对于淀粉分子，短链结构单元（主要是直链淀粉）易发生短期老化，形成较为规整的网络骨架结构。但在高微波功率处理复合组（LS-CA-300），绿原酸的引入对其黏度反弹现象有明显的抑制效应，这证实了之前的结论，即绿原酸分子主要是通过干预体系中直链淀粉分子的相互作用，进而影响凝胶网络的形成。

3 结 论

本研究探讨了微波处理对莲子淀粉-绿原酸复合体系糊化性质及其流变特性的影响。结果表明，微波处理可以破坏淀粉的长链结构，进而减少淀粉链糊化后的缠结与交联，导致复合物凝胶体系的糊化性质以及流变特性均发生显著改变，其改变程度取决于微波功率。具体而言，低功率的微波处理（200～250 W、8 min）无法完全破坏淀粉的颗粒结构，此时淀粉依然具有较为完整的糊化曲线；当微波功率增加至300 W，淀粉颗粒完全破裂，大量直链淀粉提前溶出，此时复合体系中形成大量稳定的直链淀粉骨架结构，反而导致体系具有较强的凝胶缠结区；然而对于莲子淀粉-绿原酸复合组，绿原酸能够干预体系中直链淀粉分子的相互作用，这不仅一定程度上抑制了淀粉的短期老化，同时也增强了淀粉糊体系在剪切过程中构象单元的稳定性，表明微波技术可以用于改善淀粉-绿原酸双元体系的流变特性，且形成的复合物具有较好的热稳定性以及剪切稳定性。