不同光照对荞麦芽黄酮类化合物及相关代谢酶基因表达的影响

程佳丽，刘 军，毛佳奇，李 翠，刘海杰

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

荞麦富含维生素、必需氨基酸和黄酮类化合物，是一种具有较高营养价值的作物[1-2]，但目前荞麦多以原粮形式低价出售，精深加工和产品开发依然处于较落后的状态[3]。我国是苦荞产量最大、品种资源最丰富的国家，编入《中国荞麦品种资源目录》的品种有2 700余份[4]。不同品种荞麦营养成分差别较大，但针对适于开发利用的荞麦品种筛选的研究尚有不足。

发芽能够使荞麦总酚、总黄酮、缩合单宁等活性物质含量显著增加[5-6]，口感得到改善，且荞麦芽生产工艺简单[7]，故荞麦芽是一种值得研究的荞麦产品。植物遭受逆境胁迫会启动防御机制，产生更多具有生物活性的次级代谢产物，如外源添加Ca2+[8]、蔗糖[9]、壳聚糖[10]等均可增加荞麦芽活性，而光照是一种易操作且有效的处理方式，研究表明光照处理可以提高植物及细胞的抗氧化活性[11]；发光二极管（light-emitting diode，LED）光源具有质量轻、体积小、节能等优势，有巨大的市场应用潜力。

黄酮类化合物作为植物的次级代谢产物，是相关代谢酶与基因通过复杂的协同调控产生的。有研究表明，微酸性电解水处理[12]、超声波和微波处理[13]能提高荞麦芽中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性，但目前针对相关酶基因表达方面的研究报道较少。本研究通过分析不同荞麦品种的发芽形态及发芽后总酚、总黄酮的含量，选出本实验条件下最适合生产荞麦芽的品种，再进行LED白光、LED白光+红光（记为红光）、LED白光+蓝光（记为蓝光）光照处理，比较荞麦芽中总酚、总黄酮含量，并分析不同光照下苦荞芽中PAL、黄酮醇合酶（flavonol synthase，FLS）、查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）及查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）基因的表达水平，从基因角度揭示其作用机理，以期为荞麦及荞麦芽的产业化和黄酮类化合物产生机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘晋荞2号’‘黔苦3号’‘川荞1号’‘西农9940’‘西农9976’‘贵红花’‘温莎甜荞’种子由中国农业科学院提供；‘蒙古1号’‘蒙古2号’和‘蒙古4号’种子由内蒙古农业科学院提供。其中‘西农9976’‘贵红花’‘温莎甜荞’为甜荞品种，其余7个品种均为苦荞品种。

甲醇、乙腈等高效液相色谱试剂（均为色谱级）北京化工厂；甲醇、Folin-Ciocalteau等（均为分析纯）西陇科学股份有限公司；芦丁、荭草苷、异荭草苷、牡荆素、儿茶素、槲皮素、槲皮苷、木犀草素标准品（均为色谱级） 国药集团化学试剂有限公司；总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、荧光实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 北京全式金生物技术公司。

1.2 仪器与设备

KQ-600 DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；PRX-480C智能人工气候箱（配有红、蓝、白LED光源） 宁波赛福实验仪器有限公司；ME 204电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TGL-185 M医用离心机长沙平凡仪器仪表有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机北京四环科学仪器厂；10Avp高效液相色谱仪 日本岛津公司；BCD-133EN冰箱 青岛海尔股份有限公司；DL-CJ-1NDII洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；HWS26电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；T100TMThermal Cycler PCR仪、CFX Connect荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；Nano-300超微量核酸蛋白测定仪 北京原平皓生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荞麦芽的制备

选种：剔除杂质和霉、虫、坏种；杀菌：质量分数10%的次氯酸钠溶液浸泡0.5 h，后用清水冲洗5～8 遍；浸种：在25 ℃黑暗条件下，水与种子以质量比4∶1浸泡18 h；催芽：将浸泡好的种子均匀摆在平铺有湿纱布的育苗盘中，置于温度25 ℃、相对湿度85%的黑暗环境中催芽48 h；发芽：温度25 ℃、相对湿度85%条件下分别进行24 h黑暗（对照）及LED白光（12 250 lx）、红光（12 250 lx LED白光+13 680 lx LED红光）、蓝光（12 250 lx LED白光+23 900 lx LED蓝光）光照16 h（8 h黑暗）发芽处理。每隔 8 h均匀喷淋蒸馏水一次；收芽：催芽48 h后收芽记为发芽0 d，于发芽后每2 d（2、4、6 d）收芽一次。将鲜样存放于－80 ℃冰箱，部分称质量备用，其余经冻干机冻干，进一步研磨过筛（80 目），得到的荞麦芽粉存放于－20 ℃冰箱待用。

1.3.2 荞麦芽发芽率及形态学指标的测定

荞麦百粒质量的测定：每个品种随机取100 粒测定其质量，取3 次平均值；对100 粒种子进行发芽率测定：取催芽48 h后的荞麦芽，当种子出现肉眼可见的胚根萌芽，且无霉变等其他不良情况时，即认定荞麦种子已经发芽。荞麦发芽6 d时，随机取60 根测量其可食部位芽长并求其平均数即为芽长；测定60 根（3 组平行，每组20 根）荞麦芽鲜质量，并求平均数即为荞麦芽鲜质量，拍照记录不同光照下发芽6 d荞麦芽的形态。

1.3.3 荞麦芽总酚含量的测定

样品的提取：称取0.025 g不同发芽时间荞麦冻干粉，分别加入5 mL体积分数80%甲醇溶液，混匀后56 ℃超声40 min，然后8 000 r/min离心5 min，取上清液，重复上述操作一次，将两次上清液混匀存于冰箱备用。

根据Folin-Ciocalteau法[7]测定总酚含量。总酚含量以每克干质量样品中所含没食子酸质量表示，单位为mg/g。

1.3.4 荞麦芽总黄酮含量的测定

样品的提取同1.3.3节。总黄酮含量测定参照文献[14]的方法进行，总黄酮含量以每克干质量样品中所含儿茶素质量表示，单位为mg/g。

1.3.5 荞麦芽芦丁及其他黄酮类化合物含量的测定

样品的提取同1.3.3节。取提取液1 mL经0.45 μm有机滤膜过滤至1.5 mL的棕色进样小瓶中，待用。

高效液相色谱条件：色谱柱：inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；流动相A：体积分数36%乙酸溶液-水（2∶98，V/V）；流动相B：水-体积分数36%乙酸-甲醇-四氢呋喃（80∶20∶900∶5，V/V）；进样量：10 μL；检测器：0～33 min波长280 nm，33～64 min波长360 nm，高效液相色谱运行条件：0～25 min，25% B相；25～35 min，25%～55% B相；35～45 min，55%～65% B相；45～50 min，65%～70% B相；50.00～50.01 min，70%～75% B相；50.01～57.00 min，75.0%～78.5% B相；57.00～57.01 min，78.5%～25.0% B相；57.01～64.00 min，25% B相。

1.3.6 基因表达的测定

1.3.6.1 苦荞芽中总RNA的提取

参考总RNA提取试剂盒说明书提取苦荞芽总RNA，整个操作需要在超净台进行。

1.3.6.2 第一链cDNA的合成

以1.3.6.1节提取的总RNA为模板，利用cDNA反转录试剂盒合成第一链cDNA，将合成的第一链cDNA保存于－20 ℃冰箱备用。

1.3.6.3 引物的设计和合成

参考文献[15-17]设计引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.6.4 荧光定量PCR分析

反应体系及反应仪器参数参考试剂盒说明书。基因相对表达量的计算应用2－ΔΔCt方法[18]。

1.4 数据统计与分析

除芽长测定外所有实验均进行3 次重复，采用Excel软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS软件中单因素方差分析法分析数据差异显著性，以P＜0.05表示差异显著，采用Origin和Excel软件作图。

深圳地铁6号线民乐停车场出入线总长约2.6公里，隧道穿越强、中、微风化花岗岩，采用TBM+局部矿山及明挖法施工。其中明挖段长71m，隧道上方为南坪快速牛咀大桥，共7根桥墩侵入隧道洞身，为不中断南坪快速交通，隧道穿越桥梁基础采用桩基托换。

2 结果与分析

2.1 荞麦品种筛选

2.1.1 不同品种荞麦的百粒质量、荞麦芽发芽率、鲜质量、芽长

不同品种荞麦的百粒质量如表2所示。10个品种荞麦的百粒质量在1.52～3.94 g之间，甜荞品种高于苦荞，其中‘西农9976’百粒质量最大，为（3.94±0.04）g。

表2 不同品种荞麦的百粒质量Table 2 100-Grain masses of different buckwheat varieties

发芽率可反映种子的活性，且能评估其是否适合加工为芽菜。由图1A可知，在苦荞品种中，‘蒙古2号’发芽率高达94%以上，是本实验中发芽率最高的品种；在甜荞品种中，‘西农9976’发芽率最高，达80%，远高于另外两种甜荞。

图1 不同品种荞麦芽的发芽率、鲜质量和芽长Fig. 1 Germination rates, fresh masses and sprout lengths of different varieties of buckwheat sprouts

荞麦芽的鲜质量和芽长能够反映荞麦芽的长势及其感官品质。由图1B可知，甜荞的鲜质量普遍高于苦荞，这与荞麦种子的百粒质量趋势一致；在苦荞品种中，‘黔苦3号’和‘蒙古2号’的鲜质量高于其他苦荞，分别达到1.59 g/20 根和1.53 g/20 根，且‘蒙古2号’的百粒质量最小，说明其产量大；不同甜荞种子的百粒质量及其芽的鲜质量差别不明显，在3～4 g及1.80～1.98 g/20 根之间，其中‘西农9976’的鲜质量与百粒质量的比值偏小。由图1C可知，不同品种的荞麦芽可食部位芽长存在较大差异；在苦荞芽中，‘蒙古2号’可食部位芽长最长，达到70 mm；在甜荞芽中，‘西农9976’的可食部位芽长最短，为45 mm。

2.1.2 不同品种荞麦发芽过程中的总酚、总黄酮含量

酚类和黄酮类化合物是植物中普遍存在的具有活性的次级代谢产物[19]，研究发现荞麦中总酚和总黄酮含量随发芽时间的延长而增加[20]，且苦荞芽总酚含量明显高于甜荞芽[21]。由图2A可知，在苦荞芽中，发芽2、4、6 d，‘蒙古2号’总酚含量均最高，分别为38.8、48.9 mg/g和51.3 mg/g。在甜荞芽中，发芽0、2、4 d，均是‘西农9976’总酚含量最高，分别达到5.7、14.3、29.7 mg/g。由图2B可知，在苦荞品种中，发芽2、6 d，‘蒙古2号’总黄酮含量都最高，分别为42.2 mg/g和50.2 mg/g，发芽0、4 d，‘蒙古2号’总黄酮含量均较高；甜荞品种中，发芽2、4 d，‘西农9976’总黄酮含量最高，分别达10.1 mg/g和21.7 mg/g，发芽0、6 d，‘西农9976’的总黄酮含量仅低于‘贵红花’。

图2 不同品种的荞麦芽随发芽时间延长总酚及总黄酮含量的变化Fig. 2 Changes in contents of total phenols and total flavonoids in different varieties of buckwheat sprouts with germination time

‘西农9976’鲜质量较低且可食部位芽长较短，但其发芽率明显高于‘贵红花’和‘温莎甜荞’，且总酚和总黄酮含量也较高，综合考量，‘西农9976’为本实验选出的较优甜荞品种；‘蒙古2号’的发芽率最高，可食部位芽长最长，鲜质量与百粒质量的比值最大，总酚和总黄酮含量高，故‘蒙古2号’为本实验选出的较优苦荞品种。

2.2 光照对荞麦芽的影响

2.2.1 不同光照处理发芽6 d荞麦芽的形态

由图3可知，光照处理后的荞麦芽颜色发生了明显的变化，由“黄+白”转变为“绿+红”，其中蓝光光照处理的荞麦芽颜色最深，其次依次是红光、白光；经光照处理后芽长总体向短粗型转变，子叶展开。有研究表明，光照能够抑制芽的生长，其中蓝光抑制作用最为明显[22]，这与本实验的结果相吻合。

图3 不同光照处理荞麦芽的形态对比Fig. 3 Morphological comparison of buckwheat sprouts under different illumination treatments

2.2.2 不同光照对荞麦芽总酚和总黄酮含量的影响

由图4A1、A2可知，在发芽4、6 d时，3 种光照处理均提高了‘西农9976’的总酚和总黄酮含量，而在发芽2 d时，仅红光和蓝光能够提升总酚和总黄酮含量；其中红光光照的提升作用最强，与黑暗处理相比，发芽2、4、6 d总酚含量分别提高了83%、13%、13%，总黄酮含量分别提高了111%、46%、29%。由图4B1、B2可知，在发芽2、4、6 d时3 种光照处理均提高了‘蒙古2号’的总酚和总黄酮含量，其中红光提高总酚含量的作用最强，分别提高了32%、18%和33%；白光提高总黄酮含量的作用最强，分别提高了45%、40%、53%。有学者研究了光源对荞麦芽黄酮类化合物含量的影响，结果发现LED红光较荧光和LED蓝光提升作用更强[22]；也有研究发现LED蓝光较荧光和红光能够显著提高甜荞芽总酚和总黄酮及单体黄酮含量[23]。这可能是不同研究中所用的光照强度和时长不同所致。

图4 不同光照处理的荞麦芽随发芽时间延长总酚含量变化Fig. 4 Changes in total phenol content in buckwheat sprouts under different illumination conditions with germination time

2.2.3 不同光照处理荞麦芽黄酮类化合物分析结果

大量研究表明，荞麦芽中除富含芦丁，也含有一定量的荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素、槲皮素等其他黄酮类化合物[19,24]，但这些黄酮类化合物在不同光照下含量的变化鲜有研究。本实验通过高效液相色谱对不同品种荞麦黄酮类化合物进行定量分析，结果如表3所示，槲皮苷、木犀草素和槲皮素主要存在于苦荞‘蒙古2号’中，在甜荞‘西农9976’中几乎未检出；‘蒙古2号’中芦丁含量远高于‘西农9976’；发芽6 d后，‘蒙古2号’的牡荆素、荭草苷、异荭草苷、芦丁、槲皮苷含量在白光光照下达到最高，分别较对照组提高14%、63%、69%、17%、33%；发芽6 d甜荞‘西农9976’中牡荆素、荭草苷和异荭草苷含量明显高于苦荞‘蒙古2号’，且在白光和红光光照下达到最高。研究表明不同的光照可以提高荞麦芽中荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素和芦丁的含量[22]，这与本实验结果一致；但槲皮素含量的变化与文献[11]结果不同，原因可能是本实验通过LED不同光间的复合，与文献[11]中UV光和LED光的复合不同。

表3 不同光照处理的荞麦芽发芽6 d后黄酮类化合物含量的变化Table 3 Changes in flavonoid contents of buckwheat sprouts treated with different lights after germination for 6 days

2.2.4 不同光处理苦荞芽中PAL、FLS、CHS、CHI的表达及与其黄酮类化合物含量相关性分析结果

由图5可知，光照可以显著上调苦荞芽中CHI、CHS、FLS和PAL的相对表达量。在整个发芽过程中，苦荞芽CHI和CHS的表达水平总体趋势较为相近，均是随发芽时间延长呈下降趋势，在发芽第2天相对表达量最高；苦荞芽FLS和PAL的表达水平总体趋势较为相近，均是先升高后降低，在发芽第4天相对表达量最高，这与前人研究结果[25]一致；CHS、CHI和PAL在红光光照下相对表达量达到最高，明显高于蓝光和白光处理，其中CHS相对表达量最高约达到对照组的30 倍，CHI相对表达量最高约达到对照组的25 倍，PAL相对表达量最高约达到对照组的10 倍；而FLS在红光和白光两种光照下相对表达量均较高，最高分别是对照组的50 倍和42 倍。

图5 不同光照处理的苦荞芽中CHI、CHS、FLS和PAL的表达Fig. 5 Expression levels of CHI, CHS, FLS and PAL in tartary buckwheat sprouts under different light illumination treatments

由表4可知，苦荞芽中总酚、总黄酮、荭草苷、异荭草苷及槲皮苷含量与CHI、CHS、PAL和FLS的表达水平呈极显著正相关（P＜0.01）；儿茶素和槲皮素含量与CHI、CHS、PAL和FLS的表达水平呈显著负相关（P＜0.05，P＜0.01），木犀草素含量与基因CHI、CHS和PAL的表达水平呈显著负相关（P＜0.05，P＜0.01）；而牡荆素含量只与FLS的表达水平呈显著正相关（P＜0.05）；芦丁含量与基因CHI和FLS的表达水平呈显著正相关（P＜0.05，P＜0.01）。与黑暗处理相比，光照处理明显上调了4 种基因的表达水平，也提高了酚类黄酮类物质的含量，说明CHI、CHS、PAL和FLS的表达与黄酮类化合物及酚类物质的合成存在一定的潜在关系。

表4 总酚和总黄酮含量、单一黄酮类化合物与抗氧化活性及CHI、CHS、PAL和FLS相对表达量的相关系数Table 4 Correlation coefficients between contents of total phenols,total flavonoids and individual flavonoids and relative expression levels of CHI, CHS, PAL and FLS

研究表明黄酮类化合物主要存在于子叶和茎[22,26]，但相关代谢酶基因的表达主要在根部和茎部[15,25]，黄酮类化合物可以从植物的合成位点向根尖、中根或子叶进行长距离运输[27-28]，但基因表达的部位是确定的（图6）。考虑到荞麦芽根部黄酮类化合物含量低且口感差，本实验仅针对可食部位进行研究，这可能是造成不同实验组之间的基因表达水平与其总酚和总黄酮等含量相关性不显著的原因。

图6 植物中黄酮类化合物分布及传输Fig. 6 Distribution and transmission of flavonoids in plants

3 讨 论

本实验所选7个苦荞品种中，‘蒙古2号’发芽率最高、产量最大，外观长势好，活性物质含量较高，为最优苦荞品种；本实验所选3个甜荞品种中，‘西农9976’发芽率远高于‘贵红花’和‘温莎甜荞’，且其形态粗壮、长势良好，整体活性物质含量与其他两个品种差异较小，为最优甜荞品种。LED白光、红光和蓝光光照处理均提高了荞麦芽中总酚、总黄酮、芦丁、牡荆素、荭草苷、异荭草苷及槲皮苷含量，该结果与Zhang Xiaoyan等[29]研究中LED光照提高荞麦芽等芽菜活性成分的结论基本一致。其中，对于甜荞芽‘西农9976’，红光光照是最佳处理方式，这与文献[23]中甜荞芽在LED蓝光光照下活性成分含量最高有一定出入，可能是所用荞麦品种及光照强度存在差异所致，但也有研究表明甜荞芽的芦丁、槲皮素等活性成分含量在LED红光光照下更高[22]；对于苦荞芽‘蒙古2号’，提升总黄酮、芦丁、牡荆素、荭草苷、异荭草苷、槲皮苷含量的最佳处理方法是白光光照，发芽6 d时，其中荭草苷、异荭草苷含量分别提高了63%、69%，而提升总酚含量的最佳处理方式是红光光照，这与文献[30]中红蓝光复合处理为最佳处理方式不完全吻合，这同样可能是所用荞麦及光源具体参数不同所致。不同光照均可以显著上调苦荞芽中CHI、CHS、FLS和PAL表达水平，这与光照提高苦荞芽总酚和总黄酮类化合物含量的结果相印证，相关性分析结果明确了PAL、FLS、CHS和CHI对荞麦芽中总酚和总黄酮类化合物合成的调控作用。不同实验组之间的基因表达水平与其总酚和总黄酮等含量部分相关性不显著可能缘于植物中次级代谢产物合成过程的复杂性，还需要进一步的研究来揭示其潜在机制。