寻常型银屑病患者皮损组织中miR- 124- 3p表达水平及意义

翟翊然，曹丽楠，李伟栋

（南阳市中心医院皮肤科，河南 南阳 473000）

银屑病（Psoriasis Vulgaris，PV）是一种表皮过度增殖的慢性炎症性皮肤病, 其发病机制非常复杂,目前认为炎症、表皮细胞过度增殖和免疫学异常是其发病机制的3 个中心环节[1]。 miR -124-3p是微小RNAs（microRNAs，miRNAs）的一员，在胶质瘤、膀胱癌、肝细胞癌和肺癌等恶性肿瘤的转化和发展中表现出显著的抑制作用[2]。 近年来研究显示，miR-124-3p 在特应性湿疹患者的慢性皮损皮肤中表达降低[3]，可以靶向调节信号转导与转录激活因子3（Signal transduction and transcriptional activators 3，STAT3）蛋白表达，参与炎症、多组织损伤等[4,5]。 STAT3 是一种重要的转录因子，参与炎症反应、 角质形成细胞过度增生等多种病理生理过程，在PV 发病中起重要作用[6]。 基于此，我们推测miR-124-3p 可能作为STAT3 的上游调节因子，参与PV 的发生和进展，但其具体作用和机制尚不清楚。 本研究检测miR-124-3p 及STAT3 在寻常型银屑病皮损组织中的表达，并探讨miR-124-3p 参与银屑病的发病机制，以期为寻常型银屑病的临床治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月-2020年7月在本院确诊的102 例寻常型银屑病患者，男62 例，女40 例，年龄24～65岁，平均40.15±9.83岁，其中进行期患者50 例，静止期患者52 例，病程6 个月～17年。 纳入标准：⑴所有患者按照《中国银屑病诊疗指南》（2018 版）标准进行诊断[7]，并经组织病理检查确诊；⑵患者行为能力正常，能积极配合本次研究，且病历资料完整；⑶年龄≥18岁。 排除标准：⑴患者3 个月内服用治疗药物，例如：糖皮质激素、免疫抑制剂等；⑵并发其他疾病者，例如：凝血障碍性疾病、恶性肿瘤、其他自身免疫性疾病及感染性疾病者；⑶随访过程中无法联系者、病历资料不完整者；⑷术前已行放疗、化疗者。 另收集102例正常人皮肤组织（经整形外科手术切除）作为对照组，男57 例，女45 例，年龄22～60岁，平均38.25±8.19岁，两组间性别与年龄比较均无统计学差异（P 值均＞0.05）。 本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 RNA 抽提试剂Trizol （广州泰勒生物科技有限公司）；miRNA 分离试剂盒（Ambion miRNA Isolation Kit，美 国Ambion 公 司）；miR -124-3p 特异性引物和U6 内参特异性引物均由上海艾研生物科技有限公司设计合成，序列为：miR-124-3p 上游引物5'-GGGTATTGAG -GAAGGTGTT-3'、下游引物5' -CAGTGCGTGTCGTG -GAGT-3'；内参U6 上游引物5'-GAGCCACAGCGTAACG-3'、下游引物5' -CTAGCA -CATAGTACAGG-3'；STAT3 兔多克隆抗体（上海江莱生物科技有限公司）；β-actin 单克隆抗体（上海江莱生物科技有限公司）；通用型二步法检测试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；鼠兔通用型二抗试剂盒（PV-6000）；DAB 显色试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京中科瑞泰生物科技有限公司）。

1.3 皮肤组织总RNA 的提取 对皮损组和对照组进行皮肤活检，两组均是大小约1cm×0.5cm 被切下的皮肤组织，然后分别剪切成2～3 小块，迅速储存在液氮中，之后放入-80℃中保存。待所有样本前处理结束后，使用液氮研磨皮肤组织至粉末状，并将研钵及杵均灭菌均保存在-80℃下，过夜，第二天将粉末倒入去RNA 酶的EP 管中，根据说明书采用Trizol 法提取细胞系总RNA。

1.4 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应 将上述抽提的总RNA 逆转录为cDNA，逆转录条件:25℃，10min；50℃，45 min；85℃，5 min。 按照PCR试剂盒说明检测成熟的miR，以cDNA 为模板，miR-124-3p 和U6 荧光探针作引物扩增，反应程序为：95℃，10 min；95℃，15s；、60℃，1min；共40 个循环。 所有试验重复3 次，相对表达量采用2-△△Ct法测定： 用△Ct 值代表基因的相对定量，△Ct 值=目的基因Ct 值-同组内参Ct 值，△△Ct 值=各样本△Ct 值-最低样本△Ct 值，基因表达的差别倍数用2-△△Ct值表示。

1.6 STAT3 表达检测 在匀浆器的球状部位加入少量皮肤组织，再加入去污剂裂解液，混合后进行匀浆，重复碾压样本3 次，使皮肤组织完全裂解。30min 后在在4℃下，12000r/min，离心5min，取适当被稀释过的上清液。 蛋白浓度采用BCA 法来测定，然后对蛋白质浓度进行调整，采用免疫印迹法（Western blot）检测皮肤组织中STAT3 的表达。 采取的具体步骤：⑴经过灌胶、加样、电泳、转膜等一系列操作后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液将膜装入其中；⑵将标本制置于室温摇床1h，然后加入一抗稀释液5ml，混合均匀，并放于4℃冰箱过夜；⑶再加入二抗稀释液（配比为1：10000）10mL置于摇床上1h，待显色后，将其置于暗室内进行压片曝光显影。 最后用Quantity-one 图像软件对结果进行分析及光密度值扫描，分别计算出目的蛋白条带与β-肌动蛋白（β-actin）的强度，然后把结果相除计算出其比值（%）。

1.5 皮损面积和严重程度评分 对患者进行PASI评分，病情程度根据PASI 评分分级，重度≥30 分、中度15～29 分、轻度＜15 分[8]。 PASI 评分=皮损面积×[0.1×（Dh+Ih+Eh）+0.2×（Du+Iu+Eu）+0.3×（Dl+Il+El）+0.4×（Dt+It+Et）]，E：红斑，I：浸润，D：鳞屑，h：头（包括颈），u：上肢，t：下肢，l：躯干，皮疹部位均为5 个等级：0～4 分。 皮损面积为（0～6）分，0%为0 分；＜10%为1 分；10%～29%为2 分；30%～49%为3 分；50%～69%为4 分；70%～89%为5 分；90%～100%为6 分。 总分（0～72）分，得分越高，皮损越严重。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，采用两样本独立t 检验比较组间差异，采用Pearson 相关分析寻常型银屑病患者皮损组织中miR-124-3p 表达水平与PASI 评分的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮损组织和正常组织中miR -124 -3p 与STAT3 的表达 寻常型银屑病患者皮损组织及对照组中均检测出有miR-124-3p 表达，皮损组及对照组中miR-124-3p 表达的2-△△Ct值分别为0.82 ±0.09 和1.20±0.17，皮损组明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05) ；通过Western blot 检测发现，皮损组和对照组STAT3 表达量分别为0.52±0.07 和0.25±0.05，皮损组显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 皮损组及对照组中miR- 124- 3p 和表达水平

2.3 miR-124-3p 和STAT3 表达水平与寻常型银屑病临床病理特征之间的关系 分析这些皮损组织样本与患者年龄、性别、病程和临床分期等病理特征发现，miR-124-3p 和STAT3 表达水平与年龄、性别和病程等病理特征无相关性（P＞0.05），但与患者的临床分期有关。 在进行期患者皮损中，miR-124-3p 表达水平更低，与静止期患者的miR-124-3p 表达水平比较差异具有统计学意义（P＜0.05）； 而进行期患者皮损中的STAT3 表达水平比静止期患者的更高，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 miR- 124- 3p 在寻常型银屑病患者皮损中的表达与临床特征的关系（±s）

表1 miR- 124- 3p 在寻常型银屑病患者皮损中的表达与临床特征的关系（±s）

临床病理特征 例数 P STAT3 t P年龄（岁）≥60岁＜60岁性别miR- 124- 3p t 1.056 0.293 1.539 0.127 48 54 0.81±0.09 0.83±0.10 0.53±0.06 0.51±0.07 1.173 0.243 0.719 0.473男女病程62 40 0.82±0.08 0.84±0.09 0.53±0.06 0.52±0.08 1.104 0.272 1.864 0.065≥5年＜5年临床分期进行期静止期42 60 0.80±0.09 0.82±0.09 0.54±0.08 0.51±0.08 7.788＜0.001 5.012＜0.001 50 52 0.75±0.08 0.89±0.10 0.56±0.08 0.49±0.06

2.4 皮损组中miR-124-3p 与STAT3 的相关性分析 采用Pearson 相关分析患者皮损组织中miR-124-3p 表达水平与STAT3 的相关性，结果发现miR-124-3p 表达水平与STAT3 呈负相关（r=-0.835, P＜0.001），见图2。

图2 皮损组中miR- 124- 3p 与STAT3 的相关性分析

2.5 miR-124-3p 和STAT3 表达量与PASI 评分的相关性分析 皮损组中所有患者的PASI 评分为10.9～29.5 分，平均18.22±7.84 分。 采用Pearson 相关分析寻常型银屑病患者皮损中miR-124-3p 表达水平及其与PASI 评分的相关性，两者呈显著负相关（r=-0.778，P＜0.001）; STAT3 表达水平及其PASI 评分的相关性，两者呈显著正相关（r=0.818，P＜0.001），见图3、4。

图3 miR- 124- 3p 表达量与PASI 评分的相关性分析相

3 讨论

图4 STAT3 表达量与PASI 评分的相关性分析相

银屑病是一种T 细胞介导皮肤病，属于慢性炎症性疾病，其特征是表皮增生、 角质形成细胞（KCs）异常分化和血管过度增生[9,10]。 银屑病除了表现为皮肤临床症状，还会发生一系列合并症，包括由银屑病导致的关节炎、 心血管疾病和代谢综合征等，其对患者的正常生活产生较大的影响[11]。 既往研究显示[12,13]，在表皮和毛囊中存在多种高表达的miRNA，包括miR-125b、miR-21、miR-203 等可以调控皮肤发育和功能，参与银屑病等多种皮肤病的发生、发展。 本研究探讨了寻常型银屑病患者皮损组织中miR-124-3p 的表达水平，结果显示miR-124-3p 在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达水平相对于对照组明显下调，STAT3 蛋白表达明显上调，说明miR-124-3p 和STAT3 表达异常可能与寻常型银屑病的发生发展有关。 既往研究显示，miR-124-3p 可以调控多种肿瘤的生物学行为，抑制胰腺癌细胞增殖和促进凋亡[14,15]。近年来研究发现，miR-124-3p 还可以促进皮损组织修复、愈合[16]，但其在银屑病发生中的调控机制尚不明确。 STAT3 是一种蛋白质，参与了细胞内和细胞外的信号传递，在角质形成细胞和免疫细胞之间的相互作用起着关键因素。 Nakajima 等[17]发现银屑病患者皮损组织中STAT3 异常活化，STAT3 通过与相应的miRNA 结合抑制角质形成细胞过度增殖,对于银屑病的发生、发展起着重要的保护作用。Shan 等[18]研究发现，miR-124-3p 通过干扰STAT3的3' 非编码区负向调控STAT3 的转录，调节细胞的生物学行为。 本研究结果显示，miR-124-3p 表达水平与STAT3 呈负相关性，提示miR-124-3p可能通过调节STAT3 蛋白表达，参与银屑病的进展。

本研究结果还显示寻常型银屑病患者皮损组织中miR-124-3p 表达量与PASI 评分具有相关性。 通过分析所选患者的临床分期以及对比PASI评分发现，皮损严重程度随着皮损面积的增大而增大，则miR-124-3p 表达水平相应降低，而STAT3 表达水平则升高。 同时，miR-124-3p 在进行期患者皮损组织中有着更低的表达水平，说明miR-124-3p 在临床上能随银屑病的病理变化而变化，但与患者性别、年龄及病程没有显著相关性。 已有研究显示，STAT3 表达水平与PASI 评分存在相关性[19]。提示miR-124-3p 和STAT3 可以作为评估寻常型银屑病严重程度的相关性因子。

综上所述，寻常型银屑病患者皮损组织中miR-124-3p 及其可能调控的靶基因蛋白STAT3表达水平与PASI 评分密切相关，可望作为疾病的进展及预后评估指标，为临床治疗银屑病提供参考。