环介导等温扩增技术（LAMP）在肺结核诊断中的应用研究

贾枫，叶海容，曾云龙，辛茶香，熊国亮，王彩纹

（江西省胸科医院，江西 南昌 330000）

结核病是由于感染了结核分枝杆菌而引起的一种慢性传染病,也是目前由单一病原菌引起人类死亡人数最多的传染病[1,2]。 我国因人口基数庞大,一直是全球结核病高负担国家之一。 据2020年世界卫生组织（WHO）报告，全球估计1000 万人感染结核病，而我国就有约84 万，居世界第三位；耐药结核以14%的占比居世界第二位[3]。 减少传染源、有效控制结核病传播的关键就在于早期发现结核病患者并进行有效治疗[4]。 目前，发现传染源的主要途径和手段仍然是细菌学检查。 涂片抗酸染色法虽然操作简单、快速，但是敏感性较差，其阳性率仅有20～30%；结核菌罗氏培养法阳性率虽相对高一些，但培养时间太久，一般需要6～8 周，难以满足临床快速诊断的需要。 环介导等温扩增技术（LAMP）是以PCR 技术为基础，在链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒温条件下进行扩增反应[5]来对结核分枝杆菌复合群DNA 进行快速检测, 其前处理简便，且闭管无污染，1h 即可完成试验。 目前，应用环介导等温扩增技术检测肺结核患者痰液标本中的结核分枝杆菌虽在国内外均有报道[6,7]，但在本省还较少涉及，本研究通过对涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良罗氏培养法的阳性检出率进行比较，来评估LAMP 法在肺结核诊断中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集140 例本院临床诊断为肺结核或怀疑为肺结核患者的痰标本作为本研究对象。 嘱所有的研究对象晨起涮口后留取深咳痰约3～5ml。

1.1.2 仪器及试剂 （1）奥林巴斯显微镜CH2，购自日本公司；（2）恒温荧光核酸扩增仪（LF-10）及核酸提取或纯化试剂盒，由日本荣研化学株式会社提供；（3）抗酸染色液自配，改良罗氏培养管购自珠海贝索生物技术有限公司；（4）BSC-ⅡB2 生物安全柜，购自济南鑫贝西公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP 技术

1.2.1.1 DNA 提取 （1）用大口径一次性吸管，从痰盒中吸取60μl 痰液加入荣研化学株式会社生产的核酸提取仪或纯化试剂盒中的含有提取液的加热管中；（2）颠倒混匀加热管3～4 次后放入恒温荧光核酸扩增仪（LF-10） 的加热模块中，90℃加热5min，对分枝杆菌进行裂解和灭活；（3）从加热器中取出加热管，冷却2min；（4）将加热管放入吸附管中，用力摇动使粉末与液体完全混合；（5）将注射帽放在吸附管的接口处，旋紧固定；（6）滴加约30μl 液体到反应管中。

1.2.1.2 LAMP 恒温扩增 将荣研化学株式会社生产的核酸提取或纯化试剂盒中的反应管放置到恒温荧光核酸扩增仪（LF-10）的反应模块中，67℃反应40min。

1.2.1.3 观察结果 将反应管转移到荧光检测器中，通过LED 灯观察反应管中有无荧光并记录结果，有荧光反应者为阳性，反之为阴性。

1.2.2 涂片抗酸染色 对同份痰标本同时进行涂片抗酸染色，镜检按照《痰涂片镜检实验室质量保证手册》进行操作。

1.2.3 改良罗氏培养 将痰标本用乙酰半胱氨酸-NaOH 溶液液化15～20min，取液化好的痰标本200μl 接种于改良罗氏培养基管中，每份标本接种2 支培养管，于37℃进行培养。 若长出可见的典型菌落者判定为阳性，可疑菌落用涂片抗酸染色法进行鉴定，接种8 周仍未见菌落生长者则判定为阴性。

1.2.4 菌种鉴定 用对硝基苯甲酸（PNB）/ 噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养基鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。

1.3 临床诊断 以中华医学会结核病学分会的《肺结核诊断和治疗指南》[8]作为临床诊断依据。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件对数据进行分析。 LAMP 法与涂片抗酸染色法检测结果的比较用配对χ2检验。 LAMP 法与改良罗氏培养法检测结果的一致性分析采用Kappa 指数法，Kappa 指数值越大，说明其吻合程度越高，Kappa 指数介于0.4～0.7 之间，提示吻合程度一般；Kappa 指数大于0.7，说明吻合性强。

2 结果

2.1 三种方法的阳性检出率 140 份痰标本中涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良罗氏培养法的阳性检出率分别是25. 71%（36/140）、43.57%（61/140）和41.43%（58/140）。 LAMP 法的阳性检出率明显高于涂片抗酸染色法，其差异有统计学意义（配对χ2检验结果=19.36，查χ20.05，1=3.84，故P＜0.05）。 三种方法检测结果的比较,见表1。

表1 三种方法检测结果的比较

2.2 菌种鉴定结果 经菌种鉴定，改良罗氏培养阳性的58 份痰标本中有57 份为结核分枝杆菌，1 份为非结核分枝杆菌。

2.3 LAMP 法与改良罗氏培养法检测结果的比较将LAMP 法与改良罗氏培养法的检测结果进行比较，两法检测结果的一致性κ=0.752，说明LAMP法在检测结核分枝杆菌方面与改良罗氏培养法有较好的吻合性。 两法检测结果的比较,见表2。

表2 LAMP 法和改良罗氏培养法检测结果的比较

3 讨论

现阶段，涂片抗酸染色法和改良罗氏培养法仍然是大多数结核病检测实验室主要的病原学检测方法，但因检出率、检测时限等局限，这些方法已经不能够满足临床诊疗的需求。 随着近年来对结核分枝杆菌全基因组的解析，一些通过检测结核分枝杆菌DNA 来达到对结核病进行快速诊断的技术也随之应运而生[9]，其中，LAMP 法作为一种快速的分子检测方法具有重要的意义[10]。

涂片抗酸染色法虽然具有操作简单、 快速得出结果的优势，但只有当痰标本中的细菌含量达到5000～10000 条/ml 时,才能被涂片抗酸染色法检出[11]，故灵敏度较低。 在本研究结果中，LAMP 法的阳性检出率明显高于涂片抗酸染色法。 有研究[12,13]显示，LAMP 法在诊断结核病方面的表现优于涂片抗酸染色法，这与本研究一致。

将改良罗氏培养的结果作为判断金标准，并结合临床诊断及患者使用抗结核药物的反应性综合判断，LAMP 法的敏感性为87.93%（51 ／ 58），特异性为87.80%（72 ／ 82）。 LAMP 法的靶序列均为结核分枝杆菌的特异性序列，因此无法识别痰标本中的非结核分枝杆菌。 随着我国NTM 的临床分离率的逐渐上升，这些用LAMP 法无法检测到的非结核分枝杆菌使得其敏感性稍有降低[14]。

本研究中有10 份标本LAMP 法检测为阳性而改良罗氏培养法检测结果为阴性。 其原因可能为培养法只能对活菌进行培养，而LAMP 法对没有活性的菌株也能进行扩增[15]，所以会造成LAMP法检测阳性而培养法为阴性的现象。 因此对阳性标本的判断还应结合临床诊断及患者使用抗结核药物的反应性。 140 份标本中有7 份LAMP 法检测结果阴性，而改良罗氏培养法的结果为阳性，除去1 例为非结核分枝杆菌外，可能存在的主要原因是两种方法所用的是同一个病人的不同份标本。 有些病人因痰量少，会留两到三份痰（菌量不均质），若使用同一份标本进行三种方法的比较，同一性应该会好一些。

有研究表明，LAMP 法在血痰标本中的阳性检出率会低于涂片抗酸染色法和改良罗氏培养法，原因可能为血液成分中含有血红蛋白等物质，能够抑制PCR 反应，故造成阳性检出率的降低[16]。 本研究中共有6 份血痰标本，其中有1 份涂片抗酸染色法与罗氏培养法均为阳性结果，而LAMP 法检测为阴性结果，但因血痰样本数量太少，无法判别是否存在差异。

本次研究所收集的标本中有一部分是临床高度怀疑为肺结核患者的痰液，但是三种检测方法的结果均为阴性，因此用三种方法检测均为阴性的病人也不能完全排除肺结核的可能，导致阴性结果的原因与痰标本的质量、 取样时间以及排菌量等因素有关。

综上所述，LAMP 法检测痰标本中的结核分枝杆菌具有灵敏性高、特异性强，不需要昂贵的仪器设备、操作简单安全、耗时较少等诸多优势，在肺结核的快速诊断中有很大的应用价值。