小麦低聚肽的结构特征及其体外抗氧化活性

刘文颖，冯晓文，程青丽，赵晓涵，李国明，谷瑞增

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015）（2.中国农业大学工学院，北京 100083）

小麦是我国主要的经济作物，其加工副产物小麦蛋白，即谷朊粉，主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，其蛋白含量高达85%左右。小麦蛋白营养丰富，氨基酸组成比较齐全，但由于小麦蛋白具有独特的结构，并且氨基酸主要为疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，使得分子内疏水作用区域较大，在水中的溶解度较低，使小麦蛋白的应用受到了一定的局限[1-2]。因此，通过生物酶解法使蛋白质水解，能够提高其溶解度，同时改善其功能特性。

小麦低聚肽是由小麦蛋白经酶解、喷雾干燥等手段制得的多肽混合物[3]。与小麦蛋白相比，小麦低聚肽具有水溶性好、稳定性高、易于消化吸收等优点[4]。已有文献报道小麦肽具有抗氧化、保护肠黏膜、调节免疫、降血压、调节血液胆固醇、阿片样活性、抗过敏、抗癌等多种生理功能[5-7]。抗氧化作用是一种重要的功能活性，食物来源的抗氧化肽具有天然安全的特点，能够通过减少自由基，抑制氧化反应，降低自动氧化速率，保护细胞抵御氧化应激损伤，从而达到抗衰老的功能。此外，食源性抗氧化肽也不会像人工合成抗氧化剂那样对机体产生毒副作用。近年来大豆肽、玉米肽等天然活性肽具有较强的生物活性和生物安全性已成为国内外的研究热点。而关于小麦低聚肽的结构表征和抗氧化方面系统而全面的研究相对较少。

本试验以小麦低聚肽为研究对象，通过扫描电镜、基础理化成分、相对分子质量分布、氨基酸组成、紫外光谱和圆二色光谱对其结构特征进行表征，并通过羟基自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和氧自由基吸收能力（ORAC）测定对其体外抗氧化活性进行研究，以期为小麦低聚肽在食品中的多元化开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷朊粉，北京中食海氏生物技术有限公司提供；分子质量标准品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Trolox（水溶性维生素E）、Fluorescein（荧光指示剂）、偶氮二异丁脒盐酸盐（AAPH），美国Sigma 公司；碱性蛋白酶（≥400000 DU/g）、中性蛋白酶（≥1600 AU/g），杜邦丹尼斯克公司；硫酸亚铁、水杨酸钠，广东汕头市西陇化工有限公司；ABTS 自由基清除能力测定试剂盒，碧云天生物技术研究所。

SpectraMax i3x 多功能酶标仪，美国MD 公司；QSY-Ⅱ型凯式定氮仪，北京强盛分析仪器制造中心；LC-20A 高效液相色谱仪，日本SHIMADZU 公司；Phenom ProX 台式扫描电子显微镜，复纳科学仪器（上海）有限公司；UV-1780 紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU 公司；Chirascan V100 圆二色谱仪，英国Applied Photophysics 公司；Spectra MR 多功能酶标仪，美国dynex 公司；A300 全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；HH-501 型超级恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；LG10-2.4A 型高速离心机，北京医用离心机厂；FD-1 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦低聚肽的制备

将500 g 谷朊粉溶解于蒸馏水中，质量浓度为10%（m/m），在水浴锅中调节pH 为8.5，温度为50 ℃，加入碱性蛋白酶4.5 g，酶解2 h。然后用0.1 mol/L 的HCl 溶液调节pH 为7.0，加入中性蛋白酶4.0 g，酶解3 h。酶解结束后，升温至95 ℃，灭酶10 min，再利用离心机8000 r/min 离心10 min，取上清液，用截留分子质量为2×106u 的陶瓷膜过滤，取中间清液，然后利用截留分子质量为1000 u 的超滤膜超滤，取滤过液，最后将溶液浓缩并冷冻干燥，得到小麦低聚肽干粉。

1.2.2 扫描电镜

将样品涂抹在样盘双面胶上，然后进行氮吹处理。处理好的样品放入扫描电镜抽真空，施加一定的电压，调整束斑尺寸待聚焦清晰后分别在500倍和1000倍下获取图像，观察区别[8]。

1.2.3 基础理化成分测定

参照国标方法对进行基础理化成分测定：GB 5009.5-2016 中的方法测定蛋白质含量；GB/T 22729-2008 中的方法测定酸溶蛋白含量；GB 5009.3-2016 中的方法测定水分含量；GB 5009.4-2016中的方法测定灰分含量[9-12]。

1.2.4 相对分子质量分布测定

利用流动相配制样品溶液为质量浓度 1.0 mg/mL，经孔径0.2 µm 聚四氟乙烯过滤膜过滤后，使用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，紫外检测器进行检测。同时配制0.1%（m/V）肽标准品溶液，过膜后进样，制作相对分子质量校正曲线。四种肽标准品为：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子质量189 u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子质量451 u）、杆菌酶（分子质量1450 u）、细胞色素C（分子质量12500 u）。色谱条件为：色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈：水：三氟乙酸，45:55:0.1（V:V:V）；流速：0.5 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃[13]。

1.2.5 氨基酸组成测定

按照GB 5009.124-2016 的测定方法，采用全自动氨基酸分析仪进行水解氨基酸和游离氨基酸组成分析[14]。

1.2.6 紫外光谱扫描

称取样品溶解于超纯水中，配制成2.0 mg/mL 的溶液，利用紫外可见分光光度计进行紫外光谱扫描，扫描波长245～320 nm[13]。

1.2.7 圆二色光谱扫描

将样品配制成1.0 mg/mL 的溶液，利用圆二色光谱仪测量样品的圆二色光谱。对于波长分析，以0.2 nm的步长和2.0 nm 的带宽扫描样品。光谱范围为190～250 nm，扫描速度为200 nm/min。从每个光谱中减去缓冲液的基线光谱，并使用Jasco 软件内置的分析函数将得到的值转换为摩尔椭圆率（θ）[8]。

1.2.8 小麦低聚肽的体外抗氧化活性测定

1.2.8.1 羟基自由基清除率测定

依次加入100 μL 不同质量浓度的样品溶液，200 μL 5 mmol/L 水杨酸乙醇溶液，200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，实验组以100 μL 5 mmol/L H2O2启动反应，测得吸光值Ax；对照组以等体积蒸馏水启动反应，测得吸光值A0。空白组以等体积蒸馏水代替样品，测得吸光值A1。涡旋震荡，于37 ℃水浴锅中反应1 h 后取200 μL 反应液在510 nm 处测定吸光值[13]。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除率测定

依次加入100 μL 0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液和100 μL 不同质量浓度的样品溶液于96 孔板中，混匀，室温避光反应30 min，然后在波长517 nm 处测定吸光值Ax；将100 μL 不同浓度的样品溶液与100 μL 无水乙醇混合，测得吸光值A0；以蒸馏水代替样品作为空白对照，与100 μL 0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液混合，测得吸光值A1[15]。

1.2.8.3 ABTS 自由基清除率测定

将100 μL ABTS 溶液和100 μL 氧化剂溶液混匀，配置成ABTS 工作母液，避光静置过夜，形成ABTS自由基储备液。使用前用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释35 倍成为ABTS 工作液。每个孔中加入200 μL ABTS 工作液。向标准曲线检测孔中加入10 μL 不同质量浓度的Trolox（水溶性维生素E）标准溶液，向样品检测孔加入样品10 μL，轻轻混匀后室温孵育6 min，于734 nm 处测定吸光值。最终样品的抗氧化能力以mmol Trolox /g 表示[16]。以Trolox 标准溶液绘制的ABTS 标准曲线如图1 所示，拟合得到方程y=-0.3957x+0.7147，R2=0.9963。

图1 Trolox 标准曲线Fig.1 Trolox standard curve

1.2.8.4 ORAC 值测定

将25 μL 样品溶液和100 μL 的Fluorescein（荧光指示剂，0.8 μmol/L）于96 孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L 偶氮类化合物AAPH 启动反应，此为实验组。分别用25 μL Trolox 标准品（6.25、12.5、25、50、250、500 µmol/L）代替样品作为阳性对照（制作标准曲线）、25 μL 磷酸缓冲液（pH=7.4，75 mmol/L）代替样品为空白对照，于37 ℃保温20 min，荧光酶标仪激发波长485 nm，发射波长530 nm，每隔5 min测定一次，测定总长时间为120 min。另外做不加AAPH 的对照。测样品的ORAC 值表示为μmol Trolox/g[17]。不同质量浓度Trolox 的动态荧光衰减曲线见图 2，由此绘制标准曲线如图 3 所示，y=0.0915x+1.4558，R²=0.9976。

图2 不同质量浓度Trolox 的动态荧光衰减曲线Fig.2 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

图3 Trolox 标准曲线Fig.3 Trolox standard curve

1.2.9 数据处理

每组数据平行测定3 次，实验结果用平均值±标准偏差表示，使用Origin 8.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜

由图4 可见，在500 倍和1000 倍放大倍数下，小麦低聚肽具有明显的球体颗粒状，表面有气孔和不规则褶皱。推测可能是由于蛋白质酶解后结构被破坏，使得粒径变小，表面暴露出更多的疏水性基团[18]。

图4 小麦低聚肽的扫描电镜Fig.4 Scanning electron microscope of wheat oligopeptides

2.2 小麦低聚肽的基础理化成分

小麦低聚肽中总蛋白质含量高达95.86%，水分和灰分含量很低，分别为3.38%和1.59%（表1）。酸溶蛋白质含量为86.17%，占总蛋白质的89.88%，表明小麦低聚肽中小分子蛋白质含量较高。游离氨基酸含量为2.43%，经计算，肽含量为83.74%。以上成分中，除水分外，其他成分均以干基计。酶解过程中蛋白质的溶解、不溶性非蛋白质物质的去除以及水解后油脂等物质的去除，使得制备的小麦低聚肽中蛋白质和肽含量较高。

表1 小麦低聚肽的基础理化成分Table 1 Basic physicochemical composition of wheat oligopeptides

2.3 小麦低聚肽的相对分子质量分布

小麦低聚肽洗脱图谱见图5。使用GPC 软件处理色谱数据，如表2 所示，小麦低聚肽中大分子蛋白较少，主要为小分子肽混合物，分子质量小于1000 u 的小肽所占比例为92.22%，重均分子质量为439.70 u。其中，分子质量在150～1000 u 的小肽占72.15%，而1000～2000，2000～3000，3000～5000，＞5000 u 的多肽分别为5.94%、1.28%、0.46%、0.10%。说明小麦低聚肽的主要成分为1000 u 以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性与分子质量大小有关，活性较强的抗氧化肽分子质量均较小，氨基酸残基的数目一般在20个以内[19]。因此，小麦低聚肽是一种具有潜力的抗氧化性物质。

图5 小麦低聚肽分子质量分布凝胶色谱图Fig.5 Gel filter chromatogram of molecular weight distribution of wheat oligopeptides

表2 小麦低聚肽的分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of wheat oligopeptides

2.4 小麦低聚肽的氨基酸组成

由表3 可知，小麦低聚肽中谷氨酸、脯氨酸含量很高，总含量为49.50 g/100 g。而色氨酸含量很低，仅为0.46±0.06 g/100 g。小麦低聚肽中含有丰富的必需氨基酸，含量为20.92 g/100 g，组成合理，具有较高的营养价值。有文献报道，许多氨基酸具有抗氧化能力，能够较好地清除自由基，如脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等[20,21]。小麦低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸含量较高。此外，小麦低聚肽中疏水性氨基酸含量为32.23 g/100 g。低聚肽中高含量的疏水氨基酸能够增加其脂溶性，从而有助于清除脂质自由基，发挥重要的抗氧化作用[22]。

表3 小麦低聚肽的氨基酸组成Table 3 Amino acid composition of wheat oligopeptides

2.5 小麦低聚肽的紫外光谱扫描

将配制成质量浓度2.0 mg/mL 的小麦低聚肽进行紫外光谱扫描，扫描波长245～320 nm。结果如图6 所示。从图中看出，小麦低聚肽在270 nm 的近紫外区有最大吸收峰，吸光度为2.0687。羰基的最大吸收波长一般为200 nm 左右，该吸收峰出现在270 nm，推测其主要原因是肽键中羰基π电子与相邻氨基的孤对电子发生p-π共轭使电子π-π*跃迁产生的吸收峰发生红移。

图6 小麦低聚肽的紫外光谱扫描Fig.6 UV scanning analysis of wheat oligopeptides

2.6 小麦低聚肽的圆二色光谱扫描

肽的结构主要为肽链一级结构和二级结构，与蛋白质的结构相比较为简单[23]。圆二色光谱图（图7）的峰位和峰形显示，小麦低聚肽的二级结构以多种构象并存，小麦低聚肽在200 nm 左右的远紫外区有负吸收，二级结构主要为β-折叠。利用CDNN 软件分析得到肽段各二级结构的含量，如表4 所示。小麦低聚肽的α-螺旋为5.83%，平行式β-折叠为3.14%，反平行式β-折叠为37.57%，β-转角为20.32%，无规卷曲为33.14%。小麦低聚肽中β-折叠及无规则卷曲含量较多，紧密且没有空腔的稳定结构即α-螺旋结构含量较少，因此分子表面疏水性较大[24]。推测原因可能是由于蛋白质酶解后空间结构展开，蛋白质分子内无序结构变多，β-折叠和无规卷曲增加，显露出来更多的疏水性位点，从而发挥特定的功能作用[25]，这也是小麦低聚肽表现出一定抗氧化能力的原因之一。

图7 小麦低聚肽的圆二色光谱扫描Fig.7 Circular dichroism spectrum of wheat oligopeptides

表4 小麦低聚肽的二级结构Table 4 Secondary structure of wheat oligopeptides

2.7 小麦低聚肽的体外抗氧化作用

2.7.1 小麦低聚肽的羟基自由基清除能力

如图8 所示，在质量浓度0～20 mg/mL 范围内，小麦低聚肽对羟基自由基的清除率呈明显的量效关系，在质量浓度为20 mg/mL 时，清除率达到90.53%，表现出很强的羟基自由基清除能力，半抑制浓度IC50值约为9.62 mg/mL。小麦蛋白被酶解成低聚肽后，使得更多的活性基团或位点暴露出来，能够终止自由基连锁反应，表现出一定的抗氧化能力[20]。阳性对照抗坏血酸对羟基自由基的清除率先迅速增加，然后趋于平缓，IC50值约为0.08 mg/mL。小麦低聚肽的羟基自由基清除能力弱于单一成分的抗坏血酸，但是作为一种天然的功能活性物质，安全性高，无潜在毒副作用。郑志强[5]等通过碱性蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解方式酶解小麦蛋白，结果表明，随着酶解物浓度的升高，DPPH 自由基清除能力也增强，与本实验结果一致。

图8 小麦低聚肽（a）和抗坏血酸（b）对羟基自由基清除率Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging effects of wheat oligopeptides (a) and ascorbic acid (b)

2.7.2 小麦低聚肽的DPPH 自由基清除能力

由图9 可知，在质量浓度0～10 mg/mL 范围内，小麦低聚肽对DPPH 自由基清除率与质量浓度呈明显的剂量关系，质量浓度为2 mg/mL 时，清除率达到60.27%，质量浓度为10 mg/mL 时，清除率为81.54%，IC50值约为1.54 mg/mL。这表明小麦低聚肽具有降低DPPH 自由基浓度，阻断脂质过氧化链式反应的能力。抗坏血酸对DPPH 自由基的清除作用也呈现出明显的量效关系，IC50值为4.13 µg/mL。小麦低聚肽的DPPH自由基清除能力可能是因为小麦蛋白酶解过程中释放出可作为质子供体的物质，与DPPH 自由基反应使其转变成稳定的反磁性分子，从而呈现出较强的抗氧化能力[26]。代卉等[27]通过小鼠模型考察了小麦活性肽清除DPPH 自由基的能力，其结果表明高剂量肽组（按100 mg/kg 体重灌胃）小鼠血清的DPPH 自由基清除率要高于低剂量肽组（按20 mg/kg 体重灌胃），与本实验小麦低聚肽的DPPH 自由基清除率变化规律保持一致。

图9 小麦低聚肽（a）和抗坏血酸（b）对DPPH 自由基清除率Fig.9 DPPH free radical scavenging effects of wheat oligopeptides (a) and ascorbic acid (b)

2.7.3 小麦低聚肽的ABTS 自由基清除能力

经计算可知，小麦低聚肽和抗坏血酸的ABTS 自由基清除率分别为3.53、29.36 mmol Trolox/g，由此可见抗坏血酸的ABTS 自由基清除能力约为小麦低聚肽的8.32 倍。小麦低聚肽的ABTS 自由基清除作用可能是由于小麦蛋白酶解后，空间构型、氨基酸组成和分子空间排列等发生变化，产生离子化的氨基或羧基等供氢体。此外，某些氨基酸如酪氨酸（Tyr）含有酚羟基，能提供质子，还原具有氧化性的自由基，从而终止自由基连锁反应，达到清除或抑制自由基的目的[18]。多项研究结果表明，小分子质量小麦肽相较大分子质量的小麦肽具有更强的抗氧化能力。小麦肽中小分子质量的肽所占比例越大，表明其水解程度越高，抗氧化活性也越高[5,28-29]。

2.7.4 小麦低聚肽的ORAC 值

结果显示，小麦低聚肽和抗坏血酸的ORAC 值分别为1035.52、1056.88 μmol Trolox/g。由此可见，小麦低聚肽与抗坏血酸的ORAC 值相当。这表明小麦低聚肽能够通过氢转移阻断自由基链式反应过程实现抗氧化作用[30]。已有研究表明，高活性的抗氧化肽具有一定的分子质量范围，分子质量小的肽一般具有较强的抗氧化活性[31]。吴明泽等[32]通过超滤将中华圆田螺肉酶解产物分离纯化为分子质量＜1、1～3、＞3 ku 的3 个组分。分子质量＜1 ku 组分的ORAC 值均显著高于另外两个组分（p＜0.05），具有良好的氧自由基吸收能力。本研究中小麦低聚肽的主要成分为分子质量＜1 ku的小肽，这可能与其具有较高的ORAC 值有一定关联。

3 结论

以谷朊粉为原料通过酶解法制备小麦低聚肽，蛋白质和肽含量为95.86%、83.74%，分子质量1000 u以下的组分占92.22%，必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分别为20.92、32.23 g/100 g，主要成分为分子质量小于1000 u 的小肽，在270 nm 波长处有最大吸收峰。二级结构以多种构象并存，α-螺旋、平行式β-折叠、反平行式β-折叠、β-转角和无规卷曲含量分别为5.83%、3.14%、37.57%、20.32%和33.14%，主要为β-折叠。小麦低聚肽对羟基自由基和DPPH 自由基的IC50值分别为9.62、1.54 mg/mL，ABTS 自由基清除能力为3.53 mmol Trolox/g，ORAC 值为1035.52 μmol Trolox/g，具有较强的抗氧化能力，为其在相关营养健康食品的开发利用提供了一定的参考依据。