中国齿小蠹属昆虫的鉴定*

王 正 马晓乾 周勤政 郑桂恒 夏吾加 张艳明 王成立 晋鹏非 吕 全 张星耀

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业和草原局森林保护学重点实验室 北京 100091； 2.黑龙江省林业科学院森林保护研究所 哈尔滨 150081； 3.青海省黄南州麦秀林场 黄南 811300； 4.红石林业局国家林木良种基地 桦甸 132400； 5.吉林省长白森林经营局 白山 134400； 6.日喀则市林业和草原局 日喀则 857000)

齿小蠹(Ips)隶属于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)小蠹亚科(Scolytinae)，广泛分布于北半球的针叶林中，主要以云杉属(Picea)、松属(Pinus)、落叶松属(Larix)等松科(Pinaceae)植物的韧皮部为食(Woodetal., 1992)。目前全球已知37种，大多数为次期性害虫，主要取食濒死或已经死亡的针叶树，但其中许多物种在种群大流行时可以导致针叶林的大面积死亡，造成巨大的生态和经济损失(Cognato, 2015)。例如，云杉八齿小蠹(I.typographus)的周期性爆发导致欧洲数千公顷欧洲云杉(Piceaabies)的死亡(Stadelmannetal., 2013)，仅2019年在德国就造成了130万m3木材的损失，直接经济损失超过180亿元，德国政府甚至出动军队参与灭虫(央视新闻, http:∥tv.cctv.com/2019/08/30/VIDEzPOPA8MktkIjcmWYBzxh190830.shtml)。在北美洲，加州十齿小蠹(I.confusus)也曾在美国造成数十万hm2松林的死亡(Anonymous, 2005)。由于缺乏有效的防控措施，齿小蠹的危害在我国也有逐年加重的趋势，仅吉林省2007年云杉八齿小蠹的发生面积即达5.5万hm2，长白山林区多处森林大面积枯死(王泽斌等, 2013)。2002—2008年，新疆阿尔泰山林区的云杉林受到云杉八齿小蠹危害，中重度受害面积超过6万hm2，造成巨大损失(岳朝阳等, 2014)。光臀八齿小蠹(I.nitidus)在青海省黄南州危害超过4 000 hm2的云杉林，发生率达到27%，仅麦秀林区发生面积就超过1 400 hm2，发生率超过57%(薛永贵等, 2003)。

目前，我国齿小蠹属昆虫的种类记载不尽相同。殷蕙芬等(1984)记载了8种，包括六齿小蠹(I.acuminatus)、重齿小蠹(I.duplicatus)、天山重齿小蠹(I.hauseri)、落叶松八齿小蠹(I.subelongatus)、光臀八齿小蠹、十二齿小蠹(I.sexdentatus)、云杉八齿小蠹，以及后被划分到瘤小蠹属(Orthotomicus)的中重齿小蠹(I.mannsfeldi)。黄复生等(2015)在此基础上增加了西藏重齿小蠹(I.stebbingi)(书中学名误写为I.ribbentropi)。Cognato(2015)对全球范围内齿小蠹的生物学、分类学与演化进行了综述，推测我国除了上述8种齿小蠹外，还有欧洲落叶松八齿小蠹(I.cembrae)、中华齿小蠹(I.chinensis)、喜马拉雅长叶松齿小蠹(I.longifolia)和香格里拉齿小蠹(I.shangrila)，共12种齿小蠹在我国分布。Cognato(2015)强调许多齿小蠹属的种类仅通过形态特征很难加以区分，需要借助序列比对和系统发育分析的分子鉴定手段。然而目前对我国齿小蠹属种类的分布报道及其分类研究大多仍停留在形态鉴定方面，缺乏DNA分子数据的支持，容易造成错误鉴定，给虫害的精准防治带来困难。

目前，基于mtDNA COⅠ基因序列比对的分子鉴定方法已经在昆虫分类中得到广泛应用。在齿小蠹属种类的鉴定方面，Stauffer(1997)最早通过mtDNA COⅠ基因与tRNALEU基因间的DNA 片段对欧洲的7种齿小蠹进行了准确鉴定。常虹等(2012)通过对从我国口岸截获的齿小蠹的mtDNA COⅠ基因片段序列的分析，证明了此方法对齿小蠹属昆虫分类鉴定的可行性。基于Ips属内COⅠ核苷酸差异的平均值，Cognato等(2007)认为尽管1.0%的碱基差异基本能确定种的界限，但不建议仅利用平均核苷酸差异来进行分类单元的界定，提出将进化谱系种(evolutionary lineage species)的概念引入到齿小蠹的鉴定，认为序列碱基差异、良好节点支持率的系统发育单系群以及明确的形态鉴别特征是种类划分的重要依据。而后，通过对全球范围内36种齿小蠹的mtDNA COⅠ基因、16S rDNA基因和Elongation Factor-1α基因进行多基因系统发育树构建，结合形态特征，发现了齿小蠹属1个新种——香格里拉齿小蠹(I.shangrila)。此外，Knizek等(2017)通过mtDNA COⅠ基因的系统发育分析和形态特征差异验证了中华齿小蠹的物种有效性。

齿小蠹属内的一些物种存在明显的种下遗传分化，表现为明确的地理种群。Lakatos等(2007)基于对mtDNA COⅠ基因的分析，发现欧洲和中国的重齿小蠹为2个不同的种群。陈大风(2013)基于mtDNA COⅠ基因证据发现了我国东北地区落叶松八齿小蠹不同地理种群的27个单倍型。Knizek等(2017)提出不同地理来源的中华齿小蠹在形态特征上并无差异，但基于系统发育分析可以分为南方种群和北方种群。

目前已知的37种齿小蠹属昆虫中，除天山重齿小蠹外均有线粒体COⅠ基因序列数据，但其中仅包含我国的落叶松八齿小蠹、光臀八齿小蠹、香格里拉齿小蠹和中华齿小蠹的极少数样本。本研究通过对我国东北、西北和西南地区主要针叶林分布区齿小蠹样本的采集，基于成虫形态特征、宿主植物种类与地理分布，同时利用与已有种mtDNA COⅠ基因数据的序列比对、系统发育分析的方法，对我国齿小蠹属的种类进行了准确的鉴定并且提供了DNA数据，为后续该类群的相关研究提供参考和鉴定依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

齿小蠹样本于2017—2020年间采自中国东北、西北和西南地区9个省份的36个采样点，涉及大兴安岭、小兴安岭、长白山、阿尔泰山、天山、横断山脉、喜马拉雅山、祁连山等主要山脉(表1)。成虫样本采集后放入透气的2.5 mL无菌离心管中带回实验室。上述采样点共采集齿小蠹12 062头，利用奥利巴斯体视显微镜(型号: SZX16)观察并记录虫体形态特征，进行初步鉴定。根据种类初步鉴定结果、宿主植物种类、地理分布等挑选代表性样本进行详细的显微观察和DNA提取及mtDNA COⅠ基因序列测定。利用奥利巴斯体视显微镜(型号: SZX7)和佳能EOS 70 D单反相机组成的成像系统拍摄成虫形态照片。

表1 代表性样本信息Tab. 1 Representative sample information

1.2 基因组DNA提取

DNA提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司(型号: EE141)。提取步骤为： 取单头虫体加入液氮充分研磨，置于无菌离心管中； 加入400 μL裂解液，震荡混匀，使样本完全悬浮； 在上述裂解液中加入7.5 μL RNaseA，充分混匀； 55 ℃孵育15 min； 加入等体积酚-氯仿，震荡混匀，12 000 r·min-1离心5 min； 小心吸取上层水相于无菌离心管中，加入等体积异丙醇，充分颠倒混匀； 12 000 r·min-1离心5 min，去上清； 加入500 μL70%乙醇，涡旋震荡5 s，12 000 r·min-1离心5 min，去上清； 再次离心1～2 min，吸净残留液体，晾干DNA沉淀，加入50～200 μL TE溶解DNA； 将DNA溶液置于-20 ℃条件下保存待用。

1.3 目的基因扩增与测序

引物C1-J-2183、C1-N-2611、C1-J-2410和TL2-N-3014(Simonetal., 1994)被用于扩增mtDNA COⅠ基因。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，PCR 扩增在ABI2720 PCR仪(美国Applied Biosystems公司) 上进行，反应体系为： 2×PCRmix(杭州宝赛生物科技有限公司, 型号: PM06)15 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，DNA模板1 μL，加入11 μL ddH2O使反应体系达到30 μL的总体积。引物序列及扩增条件见表2。扩增完成后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

续表1 Continued

表2 PCR引物与扩增条件Tab. 2 PCR primers and cycling protocols

1.4 序列比对及系统发育分析

将测序获得的序列输入BLAST，与NCBI数据库中已有的物种信息进行序列比对。而后将测序获得的序列与GenBank中下载的36种齿小蠹以及作为外群的2种瘤小蠹的COⅠ基因序列(Cognatoetal., 2007; Lakatosetal., 2007; Knizeketal., 2017)一同导入在线比对软件MAFFT v.7 (Katohetal., 2013)中进行序列比对(Alignment)。将比对后的FASTA文件导入MEGA 7.0 (Kumaretal., 2016)中进行剪切使序列矩阵两端对齐后，采用最大似然法(maximum likelihood, ML)、最大简约法(maximum parsimony, MP)和贝叶斯方法(Bayesian inference, BI)进行系统发育树的构建。利用软件RAxML-HPC v.8.2.3(Stamatakis, 2014)构建ML树，重复自举1 000次计算迭代支持率。利用软件PAUP * version 4. 0b10(Swofford, 2003)构建MP树，采用启发式随机搜索，第五碱基方法处理碱基空位，分析条件为数二等分再连接(TBR)。利用软件MrBayers3. 1. 2(Ronquistetal., 2003)构建BI树，运行jModelTest v. 2.1.7(Darribaetal., 2012)软件进行模型筛选，采用MCMC算法运行10 000 000代，使后验概率值小于0.01。利用软件FigTree v. 1.4.3(http:∥tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)和Adobe Illustrator CS6对构建完成的系统发育树进行编辑、美化。

2 结果与分析

2.1 形态特征比较

根据虫体形态特征、宿主植物种类、地理分布等挑选出52个代表性样本(详细信息见表1)，成虫形态特征见图1。

除中华齿小蠹翅盘两侧各有3齿、十二齿小蠹翅盘两侧各有6齿之外，其余8种齿小蠹的翅盘两侧都各有4齿。

中华齿小蠹体型较小，雌雄异型(图1: A1-A3、B1-B3)。区分雌雄的最明显鉴别特征为： 雌虫第二、三齿形状相同(图1: A1、A2)，雄虫第二齿呈锥形，第三齿上下同宽呈桩型(图1: B1、B2)。

重齿小蠹、天山重齿小蠹、东喜马拉雅云杉齿小蠹、香格里拉齿小蠹和西藏重齿小蠹的第二齿和第三齿着生于同一基部(图1: C1、C2、D1、D2、E1、E2、G1、G2、I1、I2、J1、J2)。其中，天山重齿小蠹雌雄异型，雌虫第二、三齿的端头距离较远，与一、四齿的端头等距排列(图1: E1、E2)。雄虫第二齿基阔顶尖，第三齿基部狭窄，顶部膨大，形如标枪端头、在四齿中最大(图1: D1、D2)。西藏重齿小蠹头部额面中线中部两侧有一对显著而对峙的颗瘤(图1: J3)。

光臀八齿小蠹、落叶松八齿小蠹和云杉八齿小蠹的形态特征极为相似。落叶松八齿小蠹可由额下部中央无额瘤(图1: K3)与光臀八齿小蠹(图1: F3)和云杉八齿小蠹(图1: L3)加以区分。云杉八齿小蠹翅盘底面呈蜡膜状(图1: L2)，而光臀八齿小蠹翅盘底面正常光亮(图1: F2)。

图1 中国齿小蠹成虫形态特征Fig. 1 Morphological characters of adult Ips species from ChinaA： 中华齿小蠹Ips chinensis(雌)； B: 中华齿小蠹I. chinensis(雄)； C: 重齿小蠹I. duplicatus； D: 天山重齿小蠹I. hauseri(雄)； E: 天山重齿小蠹I. hauseri(雌)； F: 光臀八齿小蠹I. nitidus； G: 东喜马拉雅云杉齿小蠹I. schmutzenhoferi； H: 十二齿小蠹I. sexdentatus； I: 香格里拉齿小蠹I. shangrila； J: 西藏重齿小蠹I. stebbingi； K: 落叶松八齿小蠹I. subelongatus； L: 云杉八齿小蠹I. typographus。1： 侧视图； 2： 翅盘； 3： 头部额面。A: I. Ips chinensis (female); B: I. chinensis (male); C: I. duplicatus; D: I. hauseri (male); E: I. hauseri (female); F: I. nitidus; G: I. schmutzenhoferi; H: I. sexdentatus; I: I. shangrila; J: I. stebbingi; K: I. subelongatus; L: I. typographus. 1: Side view; 2: Elytral disk; 3: Facies frontalis.

种检索表

1(2)翅盘两侧各有三齿

中华齿小蠹(I.chinensisKurenzov & Kononov)

2(1)翅盘两侧各有四齿或六齿

3(18)翅盘两侧各有四齿

4(13)第二齿与第三齿着生于同一基部

5(6)第二齿与第三齿相距很近，位于第一齿、第四齿正中间位置

香格里拉齿小蠹(I.shangrilaCognato & Sun)

6(5)第二齿与第三齿相距较远

7(8)第二、三齿与第一齿相距较远，与第四齿相距较近

重齿小蠹(I.duplicatusSahlberg)

8(7)四齿等距排列

9(10)头部额面中心偏下有一较大颗瘤，突出在额面点粒之中

天山重齿小蠹(I.hauseriReitter)

10(9)头部额面中线中部两侧有一对明显的对峙颗瘤

11(12)头部额面点粒密集

东喜马拉雅云杉齿小蠹(I.schmutzenhoferiHolzschuh)

12(11)头部额面点粒不密集

西藏重齿小蠹(I.stebbingiStrohmeyer)

13(4)第二齿与第三齿不着生于同一基部，各自独立

14(17)额下部中央有一个大颗瘤

15(16)翅盘底面光亮，似涂有一层蜡膜

云杉八齿小蠹(I.typographusLinnaeus)

16(15)翅盘底面光亮

光臀八齿小蠹(I.nitidusEggers)

17(14)额面无大颗瘤

落叶松八齿小蠹(I.subelongatusMotschulsky)

18(3)翅盘两侧各有六齿

十二齿小蠹(I.sexdentatusBoerner)

2.2 序列比对与系统发育分析

序列比对结果显示，除天山重齿小蠹外(NCBI数据库中无此物种序列)，在NCBI数据库中，与本研究获得的各条序列碱基相似度最高的序列所对应的物种，都与形态鉴定结果一致。

系统发育分析结果显示，3种系统发育分析方法(ML、MP、BI)生成了具有一致拓扑结构的系统发育树，但系统发育树中各个分支节点支持率并不完全相同。因此，分别将3种方法产生的节点支持率标注在系统发育树的相应分支节点上。系统发育分析中包含的37种齿小蠹以及作为外群的2种瘤小蠹均有各自独立的分支，且有很高的节点支持率(图2)。整体上，系统发育树的拓扑结构以及种间亲缘关系都与前人研究结果(Cognatoetal.， 2007; Cognato, 2015)一致。本研究测序的52个样本在系统发育树上表现为10个分类单元(Taxa)，分别对应10种齿小蠹(图2)。

图2 齿小蠹mtDNA COⅠ基因系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of the Ips species based on mtDNA COⅠ gene本研究的样本以粗体显示； 粗体分支表示BI的后验概率值≥0.9； ≥70%的节点支持率以ML/MP的形式标记在对应分支节点之前(*为<70%)； 标尺： 分支长度。Sequences generated are printed in bold type. Bold branches indicate posterior probability values ≥ 0.9. Bootstrap values of ML/MP ≥ 70% are recorded at nodes(*means<70%). Scale bars: branch length.

采集自黑龙江省(编号为HSZH1和HSZH2)的样本与中华齿小蠹的样本聚为1个大的分支，在该分支内，来自河北、青海、四川样本所代表的中华齿小蠹北方种群，来自云南样本所代表的南方种群(Knizeketal.， 2017)，以及与本研究采集的黑龙江样本各自聚为3个独立的亚支。

采集自西藏自治区吉隆县(编号为JL1、JL2、JL3)的样本和采集自西藏自治区亚东县(编号为YD1、YD2、YD3)的样本分别与巴基斯坦和尼泊尔的西藏重齿小蠹样本以及不丹的东喜马拉雅云杉齿小蠹样本聚为一支。

采集自青海(编号为MXXG)、甘肃(编号为HZXG1、HZXG2)和西藏(编号为CCL1、CCL2、DRXG)的样本与云南和四川的香格里拉齿小蠹样本聚为一个分支，其中，西藏样本独自聚为一个亚支且具有很高的节点支持率。

云杉八齿小蠹、光臀八齿小蠹、落叶松八齿小蠹和欧洲落叶松八齿小蠹是系统发育关系最为接近的4个物种，其中云杉八齿小蠹和光臀八齿小蠹互为姊妹种，落叶松八齿小蠹和欧洲落叶松八齿小蠹互为姊妹种。采集自新疆(编号为QH、TRY、MYT、LY、ALT、NR、FY)的样本与欧洲的样本聚为一个分支内的2个亚支。采集自我国东北地区(编号为HS、JGL、FHS、DX、BH、SSDG)的样本与俄罗斯伯力(远东地区)的样本聚为一支。采集自西藏(编号为LWQ1、LWQ2、LWQ3)的样本与云南样本构成的亚支与青海-甘肃亚支(编号为HZGT、MXGT、QLGT)、林芝亚支(LZGT1、LZGT2)和四川样本一起构成了光臀八齿小蠹分支。采集自新疆(编号为ABLK、KBLK、LG、TRL)和我国东北地区(编号为HG、MJG、ZH、DGJ)的样本与先前报道的我国东北地区的2个落叶松八齿小蠹样本聚为一个分支，没有表现出地域分化。

采集自内蒙古(编号为BY1、BY2)的样本与先前报道的重齿小蠹中国种群的样本聚为一个分支，与重齿小蠹欧洲种群分支共同代表重齿小蠹分支。采集自新疆天山沿线(编号为YN、TS、XTS、XY)的样本聚为一个独立的分支，与重齿小蠹的系统发育关系最接近。采集自吉林(编号为MY1、MY2)和四川(编号为SC)的样本聚为一个亚支，与欧洲的十二齿小蠹样本亚支共同组成十二齿小蠹分支，2个亚支均有很高的节点支持率。

3 讨论

齿小蠹属目前共有37个种，23个种分布于中北美洲、14个种分布于欧亚大陆(Cognato, 2015)。本研究对我国东北、西北和西南地区针叶林中的齿小蠹属昆虫进行了调查和采集，通过成虫形态特征鉴定，结合基于mtDNA COⅠ基因的分子鉴定和系统发育分析，准确鉴定出10种齿小蠹在我国大陆境内的分布，占到全球物种的27%、欧亚大陆物种的71.4%，包括： 中华齿小蠹、重齿小蠹、天山重齿小蠹、光臀八齿小蠹、东喜马拉雅云杉齿小蠹、十二齿小蠹、香格里拉齿小蠹、西藏重齿小蠹、落叶松八齿小蠹和云杉八齿小蠹。

除了mtDNA COⅠ基因之外，核糖体28S也常被用于小蠹亚科昆虫的分子鉴定，但较少用于齿小蠹的鉴定。截至目前，仅Cognato(2013)报道了16种齿小蠹的16条28S序列，但该文是为了解决小蠹亚科中的Premnobiini族内的分类问题，而非对齿小蠹属的种类进行鉴定，而且仅选择了全球37种齿小蠹中一部分(仅16种)进行了系统发育分析。这16种齿小蠹中在我国分布的仅3种。因此，由于缺少其他齿小蠹种类的28 序列作为参比序列而无法进行整个齿小蠹属的基于28S序列的系统发育分析。此外，基于mtDNA COⅠ基因片段的系统发育分析已被国内外多篇文献证明可以对齿小蠹种类进行准确鉴定(Stauffer, 1997; Staufferetal., 2001; Cognatoetal., 2007; 常虹等, 2012; 陈大风, 2013; Cognato, 2015; Knizeketal., 2017)，本研究的系统发育分析结果也印证了这一点。同时，多项研究表明，mtDNA COⅠ基因片段不仅可以准确鉴定不同齿小蠹种类，还能在一定程度上区分一些种类的种下遗传分化(Lakatosetal., 2007; Knizeketal., 2017)。与前人研究相比，本研究加入了更多不同地域齿小蠹个体的mtDNA COⅠ基因片段序列进行分析，在系统发育分支与种类界定一致的基础上，也发现了7种齿小蠹的种下遗传分化。这些结果包括系统发育树的拓扑结构、种下遗传分化特征都与前人文献已有报道高度一致。

尽管云杉八齿小蠹、落叶松八齿小蠹和光臀八齿小蠹3个种的形态特征极为相似，但根据额瘤的有无和翅盘底面正常光亮/蜡膜状能够将它们区分开(图1)。序列比对和系统发育分析也进一步支持了形态鉴定的结果，同时表明3个种的亲缘关系也最为接近。其中，云杉八齿小蠹是欧亚大陆云杉林中危害最为严重的森林害虫之一，在欧洲、我国东北和新疆阿尔泰山地区、俄罗斯远东地区和日本北海道地区均造成过严重危害(Furuta, 1989; Grégoireetal., 2004; 王泽斌等, 2013; 岳朝阳等, 2014)。在日本分布的云杉八齿小蠹被认为是区别于欧洲种群的独立变型I.typographusf.japonicus(Staufferetal., 2000)。本研究系统发育分析表明我国东北地区的样本与俄罗斯远东地区的样本聚为一支，新疆地区的样本与欧洲的样本聚为一支并且自身也是独立的亚支，分析结果支持我国东北地区和新疆地区的云杉八齿小蠹为2个已产生遗传分化的不同地理种群。日本在地理位置上同我国东北和俄罗斯远东地区十分接近，但是限于缺少日本样本的DNA数据，所以目前暂无法确定分布于日本的云杉八齿小蠹是否与分布于我国东北和俄罗斯远东地区的云杉八齿小蠹为同一种群。

落叶松八齿小蠹一度被国外研究者认为是欧洲落叶松八齿小蠹的同物异名(Woodetal., 1992; Pfeffer, 1995)，但我国学者历来认为是2个不同的物种(殷惠芬等, 1984; 黄复生等, 2015)。Stauffer等(2001)认为基于线粒体DNA序列和各自伴生真菌的不同应分别属于2个不同的物种。落叶松八齿小蠹主要分布于欧亚大陆东北部，包括俄罗斯、蒙古、日本、朝鲜、韩国，以及我国东北、西北等地(殷蕙芬等, 1984; Staufferetal., 2001; 陈大风, 2013; Cognato, 2015; 黄复生等, 2015)。本研究支持亚洲落叶松八齿小蠹与欧洲落叶松八齿小蠹为2个不同物种的观点。另外，尽管落叶松八齿小蠹在我国广泛分布于新疆和东北地区，而且宿主也为不同种类的落叶松，但并未出现明显的遗传分化现象，在系统发育树上仍聚为一个分支(图2)，和云杉八齿小蠹表现出了不同的演化规律。据Cognato(2015)记载，欧洲落叶松八齿小蠹广泛分布于欧亚大陆的落叶松林中，在我国分布于黑龙江、吉林，但并没有直接的分子证据。陈大风(2013)在我国东北和华北五省落叶松林中的8个采样点，以及本研究在位于我国东北的13个采样点收集的大量样本，经形态特征比较和分子鉴定均没有发现欧洲落叶松八齿小蠹。

光臀八齿小蠹为我国的特有物种，主要分布于青藏高原以及祁连山等高海拔地区的云杉林中。本研究中的西藏类乌齐县采样点海拔超过3 800 m，是目前已知海拔最高的齿小蠹分布地。基于mtDNA COⅠ基因的系统发育树可以看出收集自西藏林芝的样本聚为独立的一支，与其他光臀八齿小蠹样本表现出明显的种下遗传分化。

重齿小蠹、天山重齿小蠹、香格里拉齿小蠹、西藏重齿小蠹和东喜马拉雅云杉齿小蠹的一个明显的形态特征是翅盘两侧各有四齿，其中第二和第三齿都着生于一个共同基部(图1)。重齿小蠹也是一个欧亚大陆云杉林中广泛分布的物种，Lakatos等(2007)基于对mtDNA COⅠ基因的分析，认为欧洲和中国的重齿小蠹为2个不同种群，本研究也印证了这个结果。

天山重齿小蠹在我国主要分布在新疆天山山脉。本研究自西向东沿伊犁河谷至乌鲁木齐天山东段选取了4个采集点的样本，系统发育分析表明天山重齿小蠹没有发生明显的种群分化现象。本研究首次提供了天山重齿小蠹的DNA数据。

香格里拉齿小蠹也是我国的一个特有物种，最早在2007年由Cognato等(2007)命名。系统发育分析显示，青海、四川、甘肃样本聚为一个亚支，西藏样本聚为一个亚支，云南样本位于该分支的最外围，预示该种内可能存在着地域上的种群分化。调查过程中我们发现香格里拉齿小蠹与光臀八齿小蠹的分布区域高度重合，而且二者多共同危害同一棵宿主云杉，光臀八齿小蠹主要入侵宿主植物的主干，香格里拉齿小蠹主要取食宿主植物的侧枝。

西藏重齿小蠹与近缘物种最明显的形态区别为头部额面中线中部有一对显著而对峙的颗瘤，在中线两侧，属内只有本种具有2颗额瘤的特征。本研究在西藏自治区喜马拉雅山南麓采集到的样本与此形态特征吻合(图1: J3)，系统发育分析显示其与巴基斯坦和尼泊尔的样本亲缘关系最为接近，但自己为一个独立种群(图2)。此外，西藏重齿小蠹最早被Stebbing定名为Tomicusribbentropi和T.blandfordi，Strohmeyer在1908年将其改为现在的拉丁名Ipsstebbingi并沿用至今(Cognato, 2015)。西藏重齿小蠹在我国的文献中仅出现过一次(黄复生等, 2015)，作者将其拉丁名写为Ipsribbentropi，这一拉丁名在国内外文献中从未出现过，系误用。因此我们建议使用国际上公认的拉丁名Ipsstebbingi(Cognato, 2015)。

东喜马拉雅云杉齿小蠹是本研究发现的中国新纪录种，此前被认为仅在不丹分布，20世纪80年代的大暴发曾经毁灭了不丹大面积的云杉林与松林(Schmutzenhofer, 1988)。本研究采集的样本来自与不丹接壤的西藏亚东县，系统发育分析显示所有样本与不丹样本聚为一支。东喜马拉雅云杉齿小蠹与西藏重齿小蠹的地理分布、寄主范围以及形态特征较为一致，建议通过DNA分子数据进行准确鉴定。

中华齿小蠹最早于1966年在我国南方被Kurentzov和Kononov鉴定并描述，由于其与六齿小蠹在形态学上极为相似，二者一度被认为是同物异名。Knizek等(2017)对捷克、挪威、俄罗斯的六齿小蠹以及泰国、老挝和中国河北、四川、青海、云南四省的中华齿小蠹共24个样本的mtDNA COⅠ基因进行分析，证明了中华齿小蠹分类学上的有效性，并且指出文中我国的中华齿小蠹样本是20世纪初在中国考察过程中采集到的类似于六齿小蠹的样本。另外他们发现中华齿小蠹的序列高度变异，系统发育上表现为南、北2个种群，但形态学上并无明显差异。本研究使用的样本采集自我国东北黑龙江省的小兴安岭，较前人研究使已知中华齿小蠹的分布范围大幅扩大，用于分析的DNA数据已经囊括了东北、华北、西北、西南共5个省份的标本，具有较好的代表性。此外，我国东北地区的样本在系统发育上也表现为区别于南、北种群的第3个分支(图2)。截至目前，中华齿小蠹在我国东北、华北、西北和西南均有发现，与殷蕙芬等(1984)记载的六齿小蠹在我国的分布范围高度重叠。国内外齿小蠹分类学研究和公共数据库中未报道或记录过采集自我国的六齿小蠹标本的DNA序列。Knizek等(2017)明确描述了中华齿小蠹与六齿小蠹在形态上的鉴定特征： 六齿小蠹的第2、3齿基部不相连，而中华齿小蠹的第2、3齿基部相连。然而，殷蕙芬等(1984)有对我国六齿小蠹“第2与第3齿连接”的形态特征描述。因此，殷蕙芬等(1984)描述的六齿小蠹从形态特征上来看应为中华齿小蠹。综合已有报道和本研究结果，我们推测我国可能并无六齿小蠹分布，之前报道的六齿小蠹可能均为中华齿小蠹。

十二齿小蠹同样在欧亚大陆针叶林中广泛分布，主要危害松属植物，是目前已知我国体型最大的齿小蠹，形态特征为翅盘两侧各有6齿。本研究的样本采集自吉林省长白山和四川省四姑娘山，系统发育上聚为单独的一支，与十二齿小蠹欧洲种群的样本亲缘关系最近。我国黑龙江和四川的十二齿小蠹样本与欧洲的样本地理距离遥远，宿主植物种类也不同。分布于黑龙江的十二齿小蠹主要以红松(Pinuskoraiensis)为食，分布于四川的十二齿小蠹主要以华山松(P.armandii)为食，分布于欧洲的十二齿小蠹则主要以欧洲赤松(P.sylvestris)为食。地理与宿主植物种类的不同可能共同导致了它们系统发育上的差异。

齿小蠹倾向于寄生特定属或种的针叶树(Cognato, 2015)。本次调查过程中发现，我国分布的齿小蠹具有明显的寄主偏好性。例如，云杉八齿小蠹和落叶松八齿小蠹在我国的分布地几乎相同，存在很多同时发生于云杉和落叶松混交林的情况。例如，在新疆青河县采集的落叶松八齿小蠹和云杉八齿小蠹分别来自2棵紧邻的西伯利亚落叶松和西伯利亚云杉，二者并没有出现交叉选择寄主的现象。本研究涉及的10种齿小蠹中，主要危害云杉属植物的有5种： 云杉八齿小蠹、光臀八齿小蠹、香格里拉齿小蠹、重齿小蠹和天山重齿小蠹；危害松属植物的有4种： 西藏重齿小蠹、东喜马拉雅云杉齿小蠹、中华齿小蠹和十二齿小蠹； 危害落叶松属植物的1种： 落叶松八齿小蠹。

地理隔离也是齿小蠹分化的重要驱动因素之一。西藏重齿小蠹、东喜马拉雅云杉齿小蠹和长叶松齿小蠹在系统发育上为亲缘关系最为接近的姊妹种，形态特征也极为相似。上述3种齿小蠹均分布在不丹、尼泊尔、巴基斯坦、印度和我国西藏自治区吉隆县、亚东县等喜马拉雅山南坡沿线。喜马拉雅山南坡峡谷纵横，独特的高山峡谷地貌特征造成了不同峡谷之间生物的地理阻隔(Favreetal., 2015)。这种地理阻隔很可能促进了上述3种齿小蠹的分化。与之形成鲜明对比的是，采集自我国新疆和东北地区的落叶松八齿小蠹并没有发生明显的种群分化，很可能是由于我国东北、东西伯利亚与新疆阿尔泰山之间有大面积针叶林连接，并无明显的地理阻隔。

鉴于齿小蠹近缘物种之间的形态特征十分相近，且分类特征往往是齿的大小、齿间距的大小等不易准确把握的特征。因此，建议在对我国齿小蠹进行初步形态特征鉴定后，可参考寄主以及地理分布等特点，结合基于mtDNA COⅠ基因的系统发育分析，对齿小蠹物种进行准确鉴定。本研究虽然进行了大范围的样本采集，提供了我国目前已知10种齿小蠹的mtDNA COⅠ基因数据，但调查仍未做到对我国齿小蠹分布地的全覆盖。此外，虽然文献很少记载云贵高原、秦岭以及我国东南沿海等地有齿小蠹分布，但是上述地区分布有大量针叶林，采集与鉴定工作仍需开展。

目前，齿小蠹属的分类与系统发育已经有了一个基础框架，但属内各亚属以及物种之间的关系并没有得到很好地解决(Cognato, 2015)。随着测序技术的发展，大量的遗传变异位点被检测并且用于小蠹虫的系统发育研究。例如，Godefroid等(2019)利用简化基因组测序技术(RAD: Restriction-site Associated DNA)重建了大小蠹属(Dendroctonus)(Coleoptera: Scolytinae)的系统发育、起源时间和生物地理历史，以及关键生态特征的演化。截至目前，齿小蠹属中已公布了云杉八齿小蠹的全基因组数据(Powelletal., 2020)，越来越多的基因组数据的公布将为齿小蠹属的分类与系统发育重建提供强力的数据支撑。

4 结论

基于形态特征结合mtDNA COⅠ基因的系统发育分析方法可以对我国种类丰富、分布广泛的齿小蠹属昆虫进行准确鉴定。本研究共鉴定出10种齿小蠹，包括中华齿小蠹、重齿小蠹、天山重齿小蠹、光臀八齿小蠹、东喜马拉雅云杉齿小蠹、十二齿小蠹、香格里拉齿小蠹、西藏重齿小蠹、落叶松八齿小蠹和云杉八齿小蠹，提供了种检索表与每个种的DNA数据。其中，东喜马拉雅云杉齿小蠹是我国的新纪录种，中华齿小蠹、重齿小蠹、光臀八齿小蠹、十二齿小蠹、香格里拉齿小蠹、西藏重齿小蠹和云杉八齿小蠹7种存在明显的种下遗传分化特征。此外，更正了中华齿小蠹的鉴定。本研究为后续该类群的相关研究提供了参考和鉴定依据。