森吉木霉M75 发酵粗提液对松球壳孢菌的抑菌机制研究

张 铭，梁军,2＊，李箐，谢宪，程元，张星耀,2

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091；2.昆嵛山森林生态系统国家定位观测研究站，山东 烟台 264100；3.北京市西山林场，北京 100083)

松枯梢病(又名松梢枯病shoot blight of pine)是世界范围内针叶树种上分布最广、最常见的重要林木枝干病害之一[1]。自从我国自20 世纪70 年代末报道以来，松枯梢病已蔓延至黑龙江、吉林、辽宁、陕西、江苏、湖北、福建、安徽、江西、广东和广西等10 余个省份[2]，严重危害松属（Pinus）、冷杉属（Abies）、落叶松属（Larix）、崖柏属（Thuja）、雪松属（Cedrus）、刺柏属（Juniperus）、云杉属（Picea）和黄杉属（Pseudotsuga）约8 属60 多种针叶树种[3]。该病害病原存在基因型的分化，De Wet 通过多基因系谱学和微卫星标记手段将松枯梢病原菌划分为3 个不同类型，分别为A 型Diplodia scrobiculata，B 型Diplodia seriata和C 型Sphaeropsis sapinea（同物异名：Diplodia pinea）[4]。在中国引起松枯梢病的病原菌是C 型松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）[5]，该病原菌可危害大树和幼树，大树多为侧枝发病，小树上顶梢发病，导致顶芽枯死、枯梢、根腐，严重时会出现流脂现象[6]，对松树人工林造成了严重危害。目前，对松枯梢病主要采取化学防治与营林措施相结合的防治技术[7]。但长期使用化学农药不仅会导致环境污染、农药残留、威胁人类健康，而且容易诱导病原菌产生抗药性[8]，甚至会导致病害的再次流行。而营林措施见效慢，投入成本较大。为有效防控松枯梢病，必须寻求一种生态友好的防治策略，木霉菌由于特有的拮抗和促生作用，现已成为一类应用较多的生防真菌[9]，它通过竞争、寄生或产生抗菌素等次生代谢产物，从而对病原菌起到抑制作用[10]，并能促进植物生长[11]，提高寄主抵抗性。常见的生防木霉有哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、绿色木霉（T.viride）、棘孢木霉（T.asperellum）等。研究表明，哈茨木霉ES323可有效抑制番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌菌丝生长，引起菌丝腔质液泡化并导致菌体裂解[12]。非洲哈茨木霉菌（Trichoderma afroharzianum）株NAIMCC-F-01938 发酵液可使葡萄白粉病原菌分生孢子扭曲变形，可作为安全杀菌剂在田间使用，可使葡萄白粉病发病率降低43%[13]。接种棘孢木霉可使洋葱鳞茎内酚类化合物含量提高97.6%，提高了洋葱对叶枯病的抵御能力，对洋葱叶枯病病原菌Stemphylium vesicarium具有显著的防控效果[14]。内生木霉菌株V76-12 可抑制油棕叶斑病原菌Curvularia oryzae菌丝生长，同时提高了油棕幼苗苯丙氨酸解氨酶PAL、过氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO 的活性[15]，提高了寄主植物的抗性。在前期的研究中，本实验室以松枯梢病原松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）为目标菌株，从土壤真菌中分离筛选到1 株对松球壳孢菌具有良好抑菌效果的森吉木霉菌株M75。为明确森吉木霉M75 对松球壳孢菌的抑制作用机理，本研究从森吉木霉M75 对病原菌代谢系统酶活性和电导率、丙二醛含量等方面，探究生防菌森吉木霉M75 发酵粗提液对松球壳孢菌的抑菌机制，为松枯梢病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）由中国林业科学研究院森林保护重点实验室菌种保藏中心提供。森吉木霉M75 由本实验室分离筛选获得，现保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC54490。

1.2 试验方法

1.2.1 森吉木霉M75粗提液制备将保藏的M75菌株接种于PDA 培养基上，28℃活化5 d，用打孔器选取直径5 mm 菌饼，接入装有250 mL PDB 培养液的三角瓶中，180 r·min−1、28 ℃振荡培养4 d，10000 r·min−14℃离心10 min，取上清经0.45 μm 无菌微孔滤膜过滤，得到发酵粗提液，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 松球壳孢菌菌丝团制备 将保藏的松球壳孢菌菌株接种于PDA 培养基上，28 ℃活化5 d，用打孔器选取直径5 mm 菌饼，接入装有250 mL PDB 培养液的三角瓶中，160 r·min−1、28 ℃振荡培养3～4 d，将产生的直径约为2 cm 的病原菌菌丝团用无菌水洗净后置于20 mL 含20%发酵粗提液的无菌水溶液中，静置2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h 后测定松球壳孢菌各项代谢酶活性和生理指标。以不添加发酵粗提液作为空白对照，每个时间段处理重复3 次，指标测定时技术重复3 次。

1.2.3 测定的指标 测定的病原菌代谢系统酶包括：保护酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）；糖酵解途径中的己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH）；三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）；辅酶Ⅰ含量和ATP 酶。酶活性测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

生理指标包括电导率、丙二醛（MDA）含量2 个指标。电导率测定使用电导仪测定[16]，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法[17]。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010 软件对实验数据进行统计和分析，绘图使用Origin 2018 软件。

2 结果与分析

2.1 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌代谢系统相关酶活性的影响

2.1.1 对松球壳孢菌保护酶活性的影响 如图1 所示，经森吉木霉M75 粗提液处理的前8 h 内，与对照组相比，松球壳孢菌代谢系统SOD 酶活性显著上升，并在处理8 h 时达到峰值，此时酶活性为72.717 U·（g·min）−1。说明病原菌在粗提液的处理下，前期SOD 酶活性增加以达到保护菌体的作用。处理8 h 后，SOD 酶活性大幅降低，在处理96 h 时酶活性最低，为1.510 U·（g·min）−1，说明随着处理时间增加，SOD 酶活性不断降低。对照组在前8 h 内SOD 酶活性也呈上升趋势，8 h 时酶活性达37.167 U·（g·min）−1，显著低于同时段处理组酶活性。但8 h 后，对照组SOD 酶活性呈平稳变化趋势，无大幅下降，48 h 时达峰值62.180 U·（g·min）−1，在处理96h时酶活性为52.985 U·（g·min）−1。

图1 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌保护系统酶活性的影响Fig.1 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen protective enzyme activities

经森吉木霉M75 粗提液处理的前12 h 内，CAT 酶活性快速上升并在12 h 时达到峰值，0.067 U·（g·s）−1，说明发酵粗提液导致松球壳孢菌代谢系统中过氧化氢含量增加，但处理12 h 后酶活性大幅下降，并逐渐趋于零，在处理96 h 时为0.004 U·（g·s）−1，是由于SOD 酶活性逐渐降低，及膜脂过氧化严重，导致CAT 酶活性不断降低。而对照组在48 h 内CAT 酶活性都处于上升状态，在48 h 时达到峰值0.064 U·（g·s）−1，在之后随时间增加酶活性缓慢下降，96 h 时为0.054 U·（g·s）−1，且在24 h 后对照组CAT 酶活性始终高于处理组。

在经森吉木霉M75 粗提液处理的前12 h 内，与对照组相比，松球壳孢菌代谢系统POD 酶活性显著上升，在12 h 时达到峰值，为5.733 U·（g·s）−1，在12 h 后，处理组酶活性大幅下降，并在48 h 后趋于平稳。对照组POD 酶活性一直呈上升趋势。PPO 酶活性与POD 酶活性变化趋势基本一致，处理组在10 h 时达到酶活性峰值，11.909 U·（g·s）−1，此后酶活性大幅快速下降，并在处理96 h 时达到最低值0.046 U·（g·s）−1。

2.1.2 对松球壳孢菌糖酵解途径中PK、HK 和LDH 的影响 如图2 所示，经M75发酵粗提液处理后，松枯梢病原菌松球壳孢菌菌丝团的PK、HK、LDH均随时间增加呈下降趋势，PK酶活性从初始2h时的0.550U·（g·min）−1，至96h时下降至0.033U·（g·min）−1。HK酶活性从初始2h时的0.066U·（g·min）−1，至96h时下降至0.005U·（g·min）−1。LDH 酶活性由初始2 h 的2.351 U·（g·min）−1，至96h时下降至0.122 U·（g·min）−1。而对照组的PK、HK 活力都随时间增加呈持续上升趋势，PK酶活性由初始2h的0.492U·（g·min）−1，至96h时上升至0.952 U·（g·min）−1；HK酶活性由初始2h的0.060 U·（g·min）−1，至96h时上升至0.204 U·（g·min）−1；对照组的LDH 酶活性整体趋于平稳，且酶活性始终高于处理组，说明M75 发酵粗提液对糖酵解途径中的PK、HK 及LDH 的合成产生了抑制作用，严重干扰了其正常代谢。

图2 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌糖酵解途径中关键酶活性的影响Fig.2 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen key enzyme activities in sugar metabolic pathways

2.1.3 对松球壳孢菌三羧酸循环中MDH与SDH酶活性的影响 琥珀酸脱氢酶SDH 是细胞能量代谢的重要酶类，其活性变化可直接反应细胞能量代谢状况[18]。如图3 所示，经生防菌M75 粗提液处理后，松球壳孢菌菌丝团的MDH 与SDH 酶活性在处理后的12 h 内急速下降，MDH 酶活性由初始2 h 时的15.550 U·（g·min）−1下降至24 h 时的1.275 U·（g·min）−1，之后下降趋势变缓，但仍随时间呈逐渐下降趋势，在96 h 时为0.196 U·（g·min）−1。SDH 酶活性在处理12 h 内由初始2 h 的30.327 U·（g·min）−1急速下降至9.997 U·（g·min）−1，之后下降趋势减缓，处理96 h 时为0.948 U·（g·min）−1。而对照组MDH 与LDH酶活性则随时间呈逐渐上升趋势。这说明粗提液抑制了病原菌代谢系统中MDH 和SDH 的正常合成，导致三羧酸循环停滞。

2.1.4 对松球壳孢菌辅酶I 和ATP 酶活性的影响 如图4 所示，经森吉木霉菌M75 发酵粗提液处理后的12 h 内，松枯梢病原菌松球壳孢菌菌丝团的辅酶I 含量快速下降，由2 h 的5.700%下降至1.340%，在之后随处理时间的增加不断趋于零。对照组辅酶I 含量则不断增加。

图4 森吉木霉M75 粗提液松球壳孢菌辅酶I 含量的影响Fig.4 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on the content of pathogens enzyme I

如图5 所示，经森吉木霉菌M75 发酵粗提液处理的Na+，K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP 酶活性总体上呈先上升后急速下降的趋势。处理4h时，Na+，K+-ATP酶活性达到峰值0.902 μmol Pi·（g·h）−1，处理12h时，Mg2+-ATP、Ca2+-ATP 酶活性达到峰值，分别为1.759 和3.184 μmol Pi·（g·h）−1，此后急剧下降并逐渐趋于零。对照组酶活性在24 h 内处于快速上升趋势，后上升趋缓，但酶活性在10 或12 h 后高于处理组。

图5 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌ATP 酶活的影响Fig.5 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on ATP enzyme activities

2.2 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌生理生化指标的影响

2.2.1 对松球壳孢菌电导率的影响 如图6 所示，松球壳孢菌经森吉木菌M75 发酵粗提液处理后，电导率随处理时间呈明显增大趋势，并且在各处理时段都远高于对照组，说明经处理的病原菌体电解质泄露，导致电导率值增加。

图6 森吉木霉M75 粗提液对球壳孢菌电导率的影响Fig.6 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens conductivity

2.2.2 对松球壳孢菌丙二醛含量的影响 如图7 所示，经森吉木霉M75 粗提液处理后，松球壳孢菌MDA 含量在24 h 内呈急速增加趋势，在24 h 时达到峰值，1.063 nmol·g−1，而后呈下降趋势。对照组MDA 含量整体随时间增加呈平稳上升趋势，且对照组MDA 含量始终低于处理组。

图7 森吉木霉M75 粗提液对松球壳孢菌丙二醛含量的影响Fig.7 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens MDA contents

3 讨论

木霉菌作为应用最广泛的一类生防真菌，对18 个属的29 种植物病原真菌表现出显著的抑菌活性[19]，生防菌株能够抑制病原菌的生长，必然是破坏了菌体正常的生理代谢途径[20]。森吉木霉M75发酵粗提液对松枯梢病原菌松球壳孢菌的抑制作用主要体现在，发酵粗提液有效抑菌成分可使松球壳孢菌代谢保护酶系统中的SOD、CAT、POD、PPO酶活性先上升后下降，并在处理10 h 至12 h 后显著低于正常水平，说明随着处理时间增加，氧自由基不断增多，细胞膜脂过氧化加重，导致保护系统酶活性不断降低，影响了病原菌保护酶系统的正常代谢。同时导致糖酵解途径中的HK、PK 和LDH酶活性持续下降，影响了松球壳孢菌正常的糖酵解途径[21]。作为三羧酸循环中的关键酶，SDH 和MDH 代表TCA 循环活化状态[22]，其酶活数值变化能直接反应细胞能量代谢的情况[23]，SDH 与MDH 活性降低，代表菌体的TCA 循环受阻，正常的细胞代谢无法进行。ATP 是生命体维持生命活动的能量库，其含量能在一定程度上反应出自身的生理状态[24]，辅酶I 含量可用于评价糖酵解和TCA 循环的强弱，ATP 和辅酶I 的变化曲线反映出菌体在受到发酵粗提液胁迫时，细胞代谢路径受阻，糖酵解和TCA 循环合成减慢，细胞能量供给不足[25]。MDA 是细胞膜脂过氧分解的主要产物，MDA 的含量可直接反映细胞膜过氧化程度[26]，当生物体受到胁迫时，会引起细胞质膜过氧化，使得MDA 含量大幅上升[27]，本研究中松球壳孢菌MDA 含量在处理24 h 内急剧上升，且处理组MDA 含量始终高于对照组，说明发酵液导致病原菌菌体过氧化程度加剧[28]。细胞内物质成分渗出是菌体膜脂受损的标志，能直接反映菌体细胞膜通透性的变化[29]，本研究中松球壳孢菌的电导率随处理时间增加，电导率值不断上升，说明发酵粗提液破坏了菌体细胞膜的完整性，使菌体细胞膜透性改变，导致电解质渗漏[30]，抑制了松球壳孢菌的正常生长。本研究中所用为此前分离得到的森吉木霉M75，这是森吉木霉首次应用于生物防治，目前还未见有关森吉木霉菌抑菌机理的报道，本研究对丰富生防木霉菌的资源库具有重要意义。

4 结论

通过对松枯梢病病原菌松球壳孢菌代谢系统中保护酶系统、糖代谢、三羧酸循环、能量代谢中各关键酶和电导率、MDA 含量等指标的测定，说明森吉木霉M75 发酵粗提液对松枯梢病原松球壳孢菌有较好的抑制作用，可使其代谢系统相关酶活性降低，并导致电解质外渗，电导率升高，MDA 大量累积，阻碍松球壳孢菌正常的生理代谢途径，使得病原菌无法进行正常的生理生化反应，从而抑制病原菌的生长。