肿瘤转移相关基因1和血管内皮生长因子C在肺癌中的表达及意义

刘露 董健 张勇

肺癌是一种危险程度较高的恶性肿瘤，其死亡人数正在逐年增加[1]。目前临床因治疗肺癌方法多样化，且均有可观的临床效果，但对发生转移的中晚期肺癌患者生存率仍未达到理想水平，因肺癌细胞转移而导致疗效不佳仍是未被解决的主要问题[2-4]。淋巴结转移作为肺癌发生转移的主要途径之一，对肺癌患者的术后总生存率影响较大[5]。早诊断、早干预肺癌发生和转移是提高肺癌患者生存率的重要举措，因此寻求评估肺癌转移的有效标记物对临床肺癌治疗意义重大[6]。肿瘤转移相关基因(MTA)1是MTA大家族的组成之一，在发生转移的多种上皮恶性肿瘤中异常高表达[7]。血管内皮生长因子C(VEGF-C)是VEGFs家族成员之一，既往动物研究结果证实VEGF-C在肝癌、乳腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤中异常表达[8]。此外有学者发现VEGF-C可能参与肿瘤淋巴管网结构生成和重塑过程,对肿瘤淋巴结转移起到正向或负向调节作用[9]。本研究旨在探究肺癌组织中MTA1及VEGF-C的表达，分析其与肺癌分期及转移的内在联系。

对象与方法

1.对象：2019年1月～11月于华中科技大学附属协和江北医院行肺叶切除手术及淋巴结清扫手术的肺癌患者60例，其中男40例，女20例，年龄24～56岁，平均年龄(40.22±15.32)岁。纳入标准:(1)符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2019版)》中肺癌诊断标准；(2)临床资料完整；(3)未合并其他恶性肿瘤。排除标准:(1)有靶向药物治疗史；(2)行放化疗。本研究经华中科技大学附属协和江北医院伦理委员会审核批准，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)免疫组织化学法检测MTA1和VEGF-C在肺癌组织及癌旁组织中的表达：取患者的肺癌组织及肺癌旁组织(距离肿瘤5 cm以外)作为组织标本。组织标本于甲醛溶液中固定后，经不同浓度乙醇脱水，二甲苯溶液使切片透明后，包埋于石蜡中切片，捞片后烘干，经过脱蜡和水化处理后，用抗原修复液浸泡组织切片行抗原修复。为避免组织假阳性染色，将组织置于3%的H2O2溶液中于室温下37 ℃孵育半小时。加入非免疫山羊血清，37 ℃孵育，滴加稀释的一抗(MTA1、VEGF-C抗体)后湿盒低温中过夜，DAB显色液对切片组织进行显色处理，在行苏木精复染，复染结束脱水后中性树脂封片。随机选取5个较好的视野在光镜下(400倍)观察着色细胞数量和着色程度，由病理科专业医师判断细胞阳性情况。着色细胞比例为5%以下记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，50%以上记3分。细胞着色不明显记0分，浅黄色记1分，黄色记2分，棕黄色或棕褐色记3分。着色细胞比例细胞着色计分之和为细胞阳性情况：0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。

(2)分组方法：根据性别、年龄、吸烟史、肺癌组织学类型、淋巴结N分期、肿瘤T分期及术后病理检查结果中患者体内淋巴结转移数量分别进行分组，计算并比较各组MTA1和VEGF-C阳性表达率。淋巴结N分期：N0期表示无淋巴结转移，N1期表示有支气管周围或同侧肺门淋巴结转移，N2期表示同侧纵隔或隆突下淋巴结转移。肿瘤T分期：T1期表示肿瘤浸润至黏膜及黏膜下层；T2期表示肿瘤浸润至肌层或浆膜下层，T3期表示肿瘤穿透浆膜且未累及周围器官，T4期表示直接侵犯邻近器官，含腔内扩展至十二指肠或食管。阳性表达率(%)=阳性例数/总例数×100%。

3.统计学处理：应用SPSS 18.0软件进行统计分析。计数资料以例和百分比表示，组间比较采用χ2检验。双变量相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.MTA1和VEGF-C在肺癌组织及癌旁组织中的表达情况：MTA1和VEGF-C蛋白阳性染色在肺癌细胞胞质中呈棕褐色或棕黄色，在肺癌组织中主要呈阳性表达，在癌旁组织中主要呈阴性表达。见图1、2。

2.不同性别、年龄、吸烟史、组织学类型患者肺癌组织中MTA1和VEGF-C阳性表达率比较：不同性别、年龄、吸烟史、组织学类型患者肺癌组织中MTA1和VEGF-C阳性表达率比较差异均无统计意义(P>0.05)。见表1。

注：A:肺癌组织中强阳性表达；B：肺癌组织中弱阳性表达；C：肺癌组织中阴性表达；D：癌旁组织中强阳性表达；E：癌旁组织中阴性表达图1 MTA1在肺癌组织及癌旁组织中的表达情况(免疫组化染色，×400)

注：A:肺癌组织中强阳性表达；B：肺癌组织中弱阳性表达；C：肺癌组织中阴性表达；D：癌旁组织中强阳性表达；E：癌旁组织中阴性表达图2 VEGF-C在肺癌组织及癌旁组织中的表达情况(免疫组化染色，×400)

3.不同淋巴结N分期肺癌组织及癌旁组织患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率比较：肺癌患者按淋巴结N分期可分为N0期32例、N1期10例和N2期18例。N0、N1、N2期肺癌组织患者MTA1和VEGF-C阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)。见表2。

表2 不同淋巴结N分期肺癌组织及癌旁组织患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率比较[例，(%)]

4.不同组织中N0期、N1期、N2期患者MTA1和VEGF-C阳性表达率比较：肺癌组织中N2期MTA1、VEGF-C阳性表达率均高于N0期和N1期(P<0.05)。癌旁组织N0期、N1期、N2期MTA1、VEGF-C阳性表达率两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

5.不同组织中不同淋巴结转移数量患者MTA1和VEGF-C阳性表达率比较：肺癌组织淋巴结转移数量≥3枚患者MTA1和VEGF-C阳性表达率均高于淋巴结转移数量为1～2枚患者和无淋巴结转移患者，癌旁组织淋巴结转移数量≥3枚患者MTA1和VEGF-C阳性表达率均低于淋巴结转移数量为1～2枚患者和无淋巴结转移患者(P>0.05)。见表4。

表3 不同组织中N0期、N1期和N2期患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率比较[例，(%)]

表4 不同组织中不同淋巴结转移数量患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率比较[例，(%)]

6.不同组织中不同分期患者MTA1和VEGF-C阳性表达率比较：肺癌组织MTA1阳性表达率在T3～4期高于肺癌旁组织同期(P<0.05)。肺癌组织VEGF-C阳性表达率在各T分期中比较差异均无统计学意义(P>0.05)。癌旁组织MTA1、VEGF-C阳性表达率在各T分期中比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 不同组织中不同分期患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率比较[例，(%)]

7.肺癌患者MTA1和VEGF-C阳性评分相关分析：Pearson相关分析结果显示，肺癌组织MTA1阳性评分总分与VEGF-C阳性评分总分呈正相关(r=0.394，P=0.024)。

讨 论

肺癌患者术后5年总生存率较低，癌细胞发生转移是影响肺癌患者生存的主要原因[10]。肺内淋巴系统发达[11]，因此淋巴结转移是癌细胞转移的重要途径。肺癌淋巴管生成能帮助癌细胞进行转运，同时引流肿瘤细胞至淋巴结，增加了肿瘤恶性程度。VEGF-C被认为是促淋巴管生成因子，并通过受体VEGFR-2、VEGFR-3发挥其生物学效用，能够促进癌细胞向淋巴结转移，启动淋巴系统进行全身性癌细胞扩散[12]。林川等[13]研究发现MTA1与肝癌转移过程关系密切，且控制相关信号通路的表达。陈伟妍等[14]、刘涛等[15]均通过免疫组织化学法检测到MTA1在食管癌中的表达出现异常，且其与淋巴结转移相关。

本研究结果显示，不同性别、年龄、吸烟史、组织学类型患者肺癌组织中MTA1和VEGF-C阳性表达率比较差异无统计意义，说明肺癌组织中MTA1和VEGF-C表达不受性别、年龄、组织学类型等因素影响。我们进一步对肺癌患者进行N分期后，发现N0、N1、N2期肺癌组织患者MTA1和VEGF-C阳性表达率均高于癌旁组织，提示MTA1和VEGF-C高表达是肺癌发生的高风险因素；另一方面，本研究发现肺癌组织中N2期MTA1、VEGF-C阳性表达率均高于N0期和N1期，表明肺癌组织中MTA1、VEGF-C阳性表达与淋巴结转移密切相关。进一步以淋巴结转移数量分组，发现肺癌组织淋巴结转移数量≥3枚患者MTA1和VEGF-C阳性表达率均高于淋巴结转移数量为1～2枚患者和无淋巴结转移患者，癌旁组织淋巴结转移数量≥3枚患者MTA1和VEGF-C的阳性表达率均低于淋巴结转移数量为1～2枚患者和无淋巴结转移患者，再次证实MTA1、VEGF-C阳性表达与淋巴结转移具有相关性，淋巴结转移数量(≥3枚)甚至可以影响到癌旁组织MTA1、VEGF-C的阳性表达。

本研究中肺癌组织MTA1阳性表达率在T3～4期高于肺癌旁组织，说明MTA1蛋白在肺癌组织高表达可能与肿瘤大小相关。鉴于以上MTA1和VEGF-C两种蛋白在肺癌临床特征表达趋势相似，Pearson相关分析结果显示肺癌组织MTA1阳性评分总分与VEGF-C阳性评分总分呈正相关，说明MTA1和VEGF-C在肺癌发生转移中可能具有协同作用。

综上所述，MTA1和VEGF-C在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且与肺癌的恶性程度及淋巴结转移过程密切相关，两者有望成为临床判定肺癌侵袭及转移的重要靶标。本研究仍存在不足之处，由于条件限制，纳入的病例数量较少，且未收集到N3期的病例，群体代表性较差，上述结论仍需进一步Meta分析或用实验动物模型来证实。