橄榄苦苷对酪氨酸酶抑制作用的研究

陈 静，魏鉴腾，裴 栋，陈文雅，刘建飞，邸多隆，刘晔玮*

1兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所；2中国科学院兰州化学物理研究所；3中科院西北特色植物资源化学重点实验室，兰州 730000

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)广泛存在于微生物、动植物和人体中，是参与黑色素生成过程的重要限速酶，其表达水平和活性决定着黑色素合成的速度和产量[1]。抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮肤中色素细胞的酪氨酸酶代谢，阻止色素沉着的形成，起到预防雀斑、黄褐斑、老年斑等的形成和美白等作用[2]。目前常用的酪氨酸酶抑制剂，如曲酸、氢醌具有良好的抑制能力，但会产生皮炎、皮肤过敏甚至皮肤癌等副作用[3]。因此寻找安全、有效且对人体无副作用的酪氨酸酶抑制剂是目前研究的热点。目前，研究表明许多植物提取物中的酚类、黄酮类及其衍生物、多糖类、挥发油、有机酸、香豆素类等是酪氨酸酶抑制剂的较好来源[4]。

橄榄苦苷(oleuropein)是由羟基酪醇和油橄榄骨架形成的裂环烯醚萜苷化合物，分布于整棵油橄榄，其中油橄榄叶中含量是最丰富的，其次为油橄榄果[5]。近年来,随着国内外学者对橄榄苦苷研究的不断深入,发现其具有多种生物活性，如：抗病毒作用[6]、抗肿瘤作用[7]、抗菌作用[8]、抗氧化作用[9]、降血糖作用[10]、降血压作用[11]、抗阿尔茨海默病[12]、皮肤创伤保护作用[13]等，但橄榄苦苷对酪氨酸酶活性影响的研究鲜见报道，本文通过研究橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的影响及其作用机理，旨在为橄榄苦苷作为美白成分的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小鼠B16黑色素瘤细胞(来源于日本JCRB细胞库)；Hyclone DMEM高糖培养液(美国Thermo Fisher公司)；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA溶液及青-链霉素(Biological Industries 公司)；MTT(北京索莱宝科技有限公司)；橄榄苦苷(纯度≥98%，中科院西北特色植物资源化学重点实验室自制)；蘑菇酪氨酸酶(≥1 000 U/mg，Sigma公司)；L-多巴(纯度>99%，麦克林公司)；曲酸(纯度>99%，北京索莱宝科技有限公司)；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及其他试剂均为分析纯。

CI-191C型191L气套式CO2恒温培养箱(美国精骐有限公司)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；CKX41SF型倒置显微镜(日本Olympus公司)；ELx808型酶标仪(美国 BioTek 公司)；XMTD-7000型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代

将B16细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中,培养条件为37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,每天换液，2～3天传代一次。

1.2.2 MTT法检测B16细胞的活力

参照文献[14]报道的方法，取对数生长期的B16细胞，接种于96孔板中(5×103个/100 μL/孔)，37 ℃培养24 h。实验设立对照组、不同浓度的橄榄苦苷组和曲酸组，每组设6个复孔。对照组更换新鲜培养基，橄榄苦苷组更换为含不同浓度橄榄苦苷的培养基，曲酸组更换为含不同浓度曲酸的培养基，培养48 h后，加入MTT溶液(5 mg/mL，20 μL/孔)，继续培养3 h。弃上清加DMSO(150 μL/孔)，充分振荡，待结晶物完全溶解后，酶标仪于490 nm处测各孔吸光度。按下式计算细胞相对活力：

1.2.3 B16细胞内酪氨酸酶活性的测定

参照文献[15]报道的方法，取对数生长期的B16细胞，接种于96孔板中(5×103个/100 μL/孔)，37 ℃培养24 h。实验设立对照组、不同浓度的橄榄苦苷组和曲酸组，每组设6个复孔。对照组更换新鲜培养基，橄榄苦苷组换为含不同浓度橄榄苦苷的培养基，曲酸组换为含不同浓度曲酸的培养基，培养48 h后，用PBS清洗一次,每孔加50 μL含1% Triton X-100的PBS，-80 ℃放置30 min，37 ℃孵育使细胞完全破裂，反复3次后加入L-多巴(4 mmol/L，50 μL/孔)，37 ℃孵育1 h，酶标仪于475 nm处测各孔吸光度。按下式计算细胞相对酪氨酸酶活性：

1.2.4 橄榄苦苷对酪氨酸酶活力的影响

将50 μL橄榄苦苷(终浓度为0、0.05、0.09、0.19、0.28、0.37和0.46 mmol/L)和50 μL酪氨酸酶(终浓度为25 U/mL)于37 ℃水浴保温5 min，再加入50 μL磷酸盐缓冲液(pH=6.8)和50 μLL-多巴(终浓度为0.5 mmol/L)，37℃恒温下反应10 min，475 nm下测定吸光度。曲酸作为阳性对照(终浓度为0、0.003、0.007、0.014、0.035、0.070、0.176、0.352 mmol/L)。按下式计算相对酶活力：

式中：A1和A2是橄榄苦苷、酪氨酸酶与L-多巴反应初末的吸光度；A3和A4是酪氨酸酶与L-多巴反应初末的吸光度。

按照上述测定方法，将反应液置于酶标仪中37 ℃恒温，间隔40 s测定一次，共测定10 min，选取0～5.3 min吸光度随时间的改变拟合方程，其斜率即为酶活力值。

1.2.5 橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制作用机理

按照“1.2.4”项下的测定方法。通过固定L-多巴浓度，改变酪氨酸酶浓度(终浓度为12.5、25、37.5、50、62.5 U/mL)，测定不同浓度橄榄苦苷在各浓度酪氨酸酶催化下氧化L-多巴产生的吸光度。以相对酶活力对酶浓度作图，根据图像判断橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制作用是否可逆。如果作图结果为一组直线且通过原点，则为可逆抑制；如果得到一组平行直线，则为不可逆抑制。

1.2.6 橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制类型和抑制常数

1.2.7 统计分析

2 结果

2.1 橄榄苦苷对B16黑色素瘤细胞活力的影响

由图1可见，橄榄苦苷浓度为400 μmol/L时对B16细胞有明显的损伤作用(P<0.01)，25～200 μmol/L橄榄苦苷对B16细胞既无毒性作用，也无明显的促细胞增殖作用(P>0.05)。

图1 橄榄苦苷对B16细胞活力的影响(n=6)Fig.1 Effect of oleuropein on the B16 cells viability(n=6)注：与对照组比较，**P<0.01。Note:**P<0.01 vs control group.

2.2 橄榄苦苷对B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响

由图2可见，100～200 μmol/L的橄榄苦苷对B16细胞酪氨酸酶活性有抑制作用(P<0.01)，橄榄苦苷浓度为100 μmol/L，对B16细胞酪氨酸酶活性的抑制率为8.96%±2.53%，浓度为200 μmol/L，对B16细胞酪氨酸酶活性的抑制率为33.41%±3.74%。曲酸作为阳性对照，浓度为600 μmol/L，其抑制率为13.77±1.78%。浓度为800 μmol/L，其抑制率为24.59±0.82%。相比较而言，橄榄苦苷对B16细胞酪氨酸酶活性优于曲酸。

图2 橄榄苦苷对B16细胞酪氨酸酶活性的影响(n=6)Fig.2 Effect of oleuropein on tyrosinase activity of B16 cells (n=6)注：与对照组比较，**P<0.01。Note:**P<0.01 vs control group.

2.3 不同浓度的橄榄苦苷对酪氨酸酶活力的影响

由图3可见，反应体系吸光度随反应时间的延长而逐渐增大，吸光度随时间变化的曲线通过原点，不存在迟滞效应。在相同反应时间下，随着橄榄苦苷浓度的增大，曲线的斜率不断减小，即酪氨酸酶催化氧化L-多巴的速度不断降低，说明橄榄苦苷具有抑制酪氨酸酶活性的能力。由图4、5可见，橄榄苦苷和曲酸的IC50分别为0.210、0.037 mmol/L。橄榄苦苷对酪氨酸酶抑制活性低于阳性对照曲酸，由于曲酸对皮肤的不良作用，使用受到一定的限制。

图3 橄榄苦苷对酪氨酸酶作用进程曲线Fig.3 The curve of the action of oleuropein on tyrosinase

图4 橄榄苦苷对酪氨酸酶活力的影响Fig.4 Effect of oleuropein on tyrosinase activity

图5 曲酸对酪氨酸酶活力的影响Fig.5 Effect of kojic acid on tyrosinase activity

2.4 橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制作用机理

图6为不同浓度橄榄苦苷下酶活力与酶浓度的关系。由图6可见，以酶活力对酶浓度作图时，得到一组通过原点的直线，该直线的斜率随着橄榄苦苷浓度的增大而逐渐降低，表明橄榄苦苷是通过抑制酶活力导致酪氨酸酶催化氧化L-多巴的速度减慢，而不是通过降低有效酶量所导致的，说明橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制属于可逆型抑制。

图6 不同浓度橄榄苦苷下酶浓度与酶活力的关系Fig.6 Relationship between enzyme concentration and enzyme activity under different concentrations of oleuropein

2.5 橄榄苦苷对酪氨酸酶活性的抑制类型和抑制常数

图7为橄榄苦苷的抑制类型和抑制常数。由图7A可见双倒数Lineweaver-Burk图，该图为相交于横轴一点的直线，随着橄榄苦苷浓度增大，Km值不变，Vm值逐渐减小，符合非竞争型抑制类型的特征。以米氏方程的斜率对橄榄苦苷浓度二次作图得到图7B，橄榄苦苷对游离酶的抑制常数(KI)为6.77 mmol/L。橄榄苦苷的最大酶促反应速率和米氏常数见表1，Km为0.42 mmol/L。

图7 橄榄苦苷的抑制类型(A)和抑制常数KI(B)Fig.7 Inhibition types (A) and inhibition constants (B) of oleuropein

表1 橄榄苦苷的最大酶促反应速度和米氏常数

续表1(Continued Tab.1)

3 讨论与结论

酶促反应中以测定单位时间内产物的增量来表示酶促反应速度。初速度是指在酶促反应开始的一段时间内的速度，此时，斜率几乎不变，在一定底物浓度下，由产物与时间关系曲线过零切线的斜率求得[16]。一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定酶活力，此时干扰因素较少。本实验中，在反应0～5.3 min时A475 nm-Time曲线近似呈线性关系，随着时间的延长，曲线逐渐平坦，斜率降低，反应的速度也就降低，此时测得的酶活力不能代表真实的酶活力，故取反应5.3 min时的反应速度为初速度。

体外抑制酪氨酸酶活性实验分为细胞实验和生化实验。Chan等[17]认为，细胞能够模拟真实的生理环境，通过细胞实验测定酪氨酸酶的活性比直接测定酪氨酸酶活性可靠，更能反映其抑制活性。本研究中橄榄苦苷对B16细胞酪氨酸酶抑制活性和对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性存在差异，在细胞水平上，橄榄苦苷抑制酪氨酸酶活性优于阳性对照曲酸。这与Li等[18]研究结果一致。

当人体皮肤暴露于紫外线辐射时，会产生大量的活性氧(ROS)和自由基，进而加速皮肤的老化、色素沉着、皱纹加深等[19]。研究表明，升高的ROS会通过在表皮中动员α-黑色素细胞刺激素来激活酪氨酸酶，最终刺激黑素细胞产生黑色素[20]。抗氧化剂通过清除活性氧和自由基，促进机体的正常代谢，改善皮肤的不良状况，使色素逐渐消散，从而起到美白的作用[21]。Wang等[22]研究发现，抗氧化剂：光甘草定、白藜芦醇、氧化白藜芦醇及苯乙基间苯二酚，当以L-多巴作为底物时，抗氧化活性与抑制酪氨酸酶活性之间具有协同作用，极大地抑制了酪氨酸酶活性。橄榄苦苷具有较强的抗氧化活性[9]，其抑制酪氨酸酶活性是否与抗氧化活性有关，橄榄苦苷与抗氧化剂是否存在协同作用值得进一步探索。

酪氨酸酶是黑色素合成过程中的关键酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以抑制黑色素的生成，进而达到美白的功效[23,24]。本研究结果表明，橄榄苦苷对B16细胞酪氨酸酶及蘑菇酪氨酸酶均有明显的抑制作用，呈现良好的剂量依赖关系。通过动力学分析，橄榄苦苷对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用类型为可逆性非竞争性抑制，即橄榄苦苷与酪氨酸酶的结合在底物结合部位以外的必需基团上，橄榄苦苷并不降低酪氨酸酶对底物(L-多巴)的亲和力，而是通过阻止酶的催化作用，使Vm降低从而达到抑制酶活性的作用。橄榄苦苷来源广泛，安全性高，且有较好的抗氧化活性，作为潜在的美白产品的原料具有广泛的应用前景。