间质蛋白Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及可能机制

肖 萍， 李 通， 杨晓玉， 李美香

(1.南华大学衡阳医学院组织胚胎学教研室 应用解剖与生殖医学研究所 显微形态实验中心, 湖南省衡阳市 421001;2.鄂州市中心医院检验科，湖北省鄂州市 436000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种高发于中国南方及东南亚地区的恶性肿瘤，早期症状不明显，易发生颅底浸润或远处转移[1]。间质蛋白Periostin最初是作为一种黏附分子而被发现。有学者发现其在多数肿瘤间质中高表达，主要由癌周间质细胞分泌，能促进癌细胞的侵袭和转移[2-3]。本课题组在前期研究中采用蛋白质组学结合质谱技术研究发现Periostin在鼻咽癌间质中表达上调[3]。众所周知，肿瘤细胞的无限生长与肿瘤细胞的凋亡障碍有关[4]。P53基因是一种重要的抑癌基因，可以通过调控凋亡相关基因的表达及其产物的活性来促进细胞的凋亡[5]。研究发现P53蛋白在鼻咽癌组织中过度表达[6]，但其在鼻咽癌中的促凋亡作用尚未得到系统的研究。本研究探讨Periostin对鼻咽癌细胞凋亡的调节作用及其与P53蛋白的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞分组及标本

稳定转染POSTN基因的低转移潜能NPC细胞系6-10B细胞(对照组)、6-10B-GFP细胞(空白载体对照组)、6-10B-POSTN细胞(转染组)均为本室冻存。66例鼻咽癌组织切片来源于中南大学湘雅医院病理科，54例男性和12例女性，平均年龄(48±9)岁，临床分期为Ⅱ到Ⅳ。

1.2 细胞培养

将各组细胞(6-10B/6-10B-GFP/6-10B-POSTN)复苏后培养在含10%胎牛血清和1%双抗的完全培养基中,在37 ℃、5% CO2、100%湿度的环境下培养传代。

1.3 Western blot法

提取6-10B系列细胞总蛋白并进行蛋白含量测定。取40 μg总蛋白用10%SDS-PAGE进行分离，转膜后封闭2 h；一抗Periostin(1∶2 000,ab14041)、P53(1∶1 000，ab90363,)、Bax(1∶1 000,ab32503)、Bcl-2(1∶1 000,ab185002)、anti-p-Akt(1∶5 000,ab38449)分别与印迹膜4 ℃孵育过夜;TBS-T洗膜3次×10 min;二抗室温孵育1 h;TBS-T洗膜3次×10 min，ECL发光，显影、定影。以GAPDH(1∶5 000,ab8245)为内参照。用Image J软件分析目标条带的灰度值(蛋白相对表达水平=目的蛋白组灰度值/内参灰度值)。

1.4 流式细胞术

收集生长状态良好的6-10B系列细胞约2×106个于1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清。将1 mL预冷的PBS加入每管中，洗涤3次。细胞用100 μL的1×Annexin V结合缓冲液重悬，再加入PE-AnnexinⅤ、7-AAD染色，暗室中培养15 min，每管加入400 μL的1×Annexin V结合缓冲液，上机检测。

1.5 细胞上清中分泌蛋白的浓缩

用无血清培养基培养各组细胞48 h，收集培养细胞的上清液，离心去除细胞碎片。浓缩培养上清至0.25 mL，加入等量蛋白裂解液(8 mol/L尿素，4% CHAPS，40 mmol/L Tris,65 mmol/L DTT)旋涡混匀裂解蛋白，15 000 g,4 ℃离心30 min，取上清。采用Bradford法(购自Pierce公司)测定蛋白的水平。Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。

1.6 细胞转染

取3×105个对数生长期的6-10B系列细胞接种在6孔板中，于转染前24 h换成无血清培基培养过夜，使用Lipofectamine-2000(Life Technologies，Inc.)将质粒P53 shRNA(转染组)及GV102(空白对照)转染到准备好的各组细胞中。P53 shRNA靶序列：GACTCCAGTGGTAATCTAC。

1.7 免疫组织化学检测

按试剂盒说明书操作。石蜡切片常规脱蜡，下行入水。一抗为鼠抗人P53(1∶500，英国Abcam公司产品，ab90363)，4 ℃孵育过夜，阴性对照用PBS代替一抗；二抗为生物素化羊抗鼠IgG(1∶100稀释)，DAB显色，光镜观察。

1.8 统计学分析

实验数据用Graphpad Prism8.0软件进行作图及统计学分析。Western blot条带用Imag J软件进行灰度值测定，所有实验重复3次。各组间比较采用Studentt检验和单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 Periostin转染效果验证及对细胞内凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示Periostin在6-10B细胞中高表达(图1A、B)。与对照组6-10B和6-10B-GFP组比较，6-10B-POSTN组中P53、Bax的表达显著升高，p-Akt的表达水平明显下降(P<0.05)，而Bcl-2的表达差异无显著性(图1B)，但Bax/Bcl-2的比值显著升高(图1C)，提示Perisotin可以下调p-Akt、上调Bax和P53蛋白的表达水平。

图1 Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt在6-10B系列细胞中的表达情况A为Western blotting技术检测Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白的表达；B为Periostin、P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白的定量分析;C为6-10B、6-10B-GFP和6-10B-POSTN中BAx/Bcl-2比值比较。a为P<0.05,与6-10B组或6-10B-GFP组比较。

2.2 POSTN高表达促进6-10B细胞的凋亡

与6-10B及6-10B-GFP组比较，6-10B-POSTN组细胞凋亡率升高(P<0.05；图2、表1)。

图2 POSTN基因转染对6-10B细胞凋亡的影响

表1 POSTN基因转染对各组细胞凋亡的影响 单位：%

2.3 6-10B-POSTN细胞培养上清促进6-10B细胞内凋亡相关蛋白的表达

与1640培基培养的6-10B细胞比较，凋亡相关蛋白在用6-10B细胞组及6-10B-GFP组培养上清刺激的6-10B细胞中的表达无统计学意义(图3)，但在6-10B-POSTN组培养上清培养的6-10B细胞中，P53、Bcl-2表达较对照组(1640培基)、6-10B、6-10B-GFP培养上清组下调，p-Akt表达较对照组及6-10B组下调；而Bax表达上调(图3B)，Bax/Bcl-2的比值显著升高(图3C)。提示Periostin可以上调Bax、下调p-Akt、Bcl-2和P53蛋白的表达水平。

图3 6-10B系列细胞培养上清中Periostin对6-10B细胞内凋亡相关蛋白表达的影响A为1640培基、6-10B细胞、6-10B-GFP细胞和6-10B-POSTN细胞培养上清对P53、Bax、Bcl-2和p-Akt的影响;B为P53、Bax、Bcl-2和p-Akt蛋白水平的定量分析；C为不同细胞培养组上清中Bax/Bxl-2比值的比较。a为P<0.05,与1640培基组比较。

2.4 人正常鼻咽黏膜组织和鼻咽癌组织中P53蛋白表达的比较

与鼻咽黏膜正常组织比较，P53蛋白在NPC组织中的表达显著上调(图4)。

图4 免疫组织化学方法检测P53在正常鼻咽黏膜和鼻咽癌组织中的表达(苏木精复染，200×)

2.5 鼻咽癌6-10B细胞转染shRNA-P53后对6-10B细胞凋亡率的影响

与对照组GV102比较，P53蛋白在P53-shRNA组表达明显下调(图5)。FCM检测结果显示：与6-10B-GV102组比较，6-10B-shRNA和6-10B-GFP-shRNA组细胞凋亡率的差异均无显著性，而6-10B-POSTN-shRNA组的凋亡率显著高于其他3组(P<0.05；图6)。

图5 P53 shRNA转染6-10B细胞后P53蛋白的表达

图6 FCM检测P53下调对6-10B细胞凋亡率的影响A为FCM检测P53下调前后6-10B细胞的凋亡情况；B为各组细胞凋亡率的统计分析。a为P<0.05,与6-10B-GV102组、6-10B-shRNA组和6-10B-GFP shRNA组比较。

3 讨 论

本研究利用本室冻存的高表达POSTN的6-10B稳转细胞株，探究了Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及可能机理。研究结果发现6-10B细胞中Periostin蛋白的表达可促进6-10B细胞的凋亡，上调促凋亡蛋白P53和Bax的表达，下调存活因子p-Akt的表达。目前有较多的研究提示异常表达Periostin在肿瘤的发生发展中扮演的角色不同[7]。不少研究报道在癌组织中Periostin表达下调，可抑制肿瘤的发生发展，认为其是一种抑癌蛋白，而表达上调的Periostin可促进肿瘤的发生、侵袭和转移，认为其是一种促癌蛋白[8-9]。本课题组前期研究发现Periostin在NPC组织中高表达，细胞实验显示高表达的Periostin可促进NPC细胞的侵袭和迁移[3]。在本研究中，低转移潜能6-10B细胞中高表达Periostin蛋白后细胞中促凋亡因子P53和Bax表达上调，Bax/Bcl-2比值升高，存活因子p-Akt的表达被抑制，凋亡率较对照组显著升高。研究结果提示：6-10B细胞内高表达的Periostin可促进6-10B细胞的凋亡。

本研究用6-10B-POSNT细胞培养上清刺激6-10B细胞后，细胞中促凋亡蛋白Bax的表达显著上调，Bax/Bcl-2的比值显著升高，促进细胞存活的蛋白Bcl-2、p-Akt的表达显著下调，差异均有显著性。以上结果提示：自分泌和旁分泌的Periostin都可以促进NPC细胞的凋亡。

研究发现60%以上鼻咽癌组织中存在P53蛋白的聚集[5,10-11]。P53蛋白在NPC组织中高表达，自分泌表达于NPC细胞内的Periostin可促进6-10B细胞内P53的表达，而旁分泌的Periostin却抑制6-10B细胞内P53的表达，而无论是自分泌还是旁分泌的Periostin均可促进6-10B细胞的凋亡。6-10B系列细胞中P53基因下调后，结果显示其对6-10B细胞的凋亡率没有明显影响，提示在6-10B细胞中P53没有发挥促凋亡的功能；转染了POSTN基因的6-10B细胞中，P53基因的下调也并没有影响Periostin对凋亡的促进作用。本文实验结果说明Periostin可以促进6-10B细胞的凋亡，但其不是通过P53途径来实现的，其具体机制还有待后续的进一步研究。