血清骨桥蛋白、维生素D、白三烯B4对支气管哮喘病儿诊断及预后的应用价值

郑华月，张云涵，郑春阳

流行病学调查显示，我国儿童支气管哮喘（bronchial asthma，BA）发 病 率 约 为3.00%～7.45%［1-2］，疾病反复发作所致气道重塑是造成其病程迁延的主要原因［3］。BA主要通过临床症状、体征及抗哮喘治疗效果进行诊断，而对于临床表现不典型的病人常通过支气管舒张试验、支气管激发试验、抗炎治疗后肺功能改善情况等进行诊断。但关于临床表现的内容主观性较强，且缓解期常无症状，加之儿童病史采集及问诊常会出现不准确、不完整，试验操作不配合等情况，可能会影响诊断的准确性。报道显示，细胞因子网络失衡是BA发生的病理基础［4］，而Th2细胞因子、嗜酸细胞趋化因子共同诱导嗜酸性粒细胞募集与浸润，进而引起气道炎症，可能是其发病关键因素［5］。而骨桥蛋白（OPN）是细胞外基质中一种重要的多功能磷酸化糖蛋白，在T细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞等诸多免疫细胞中呈异常表达，参与炎症免疫反应，已被证实在哮喘发病中具有重要作用［7］；白三烯B4（LTB4）是由响应炎症递质的白细胞产生，对中性粒细胞具有较强的趋化、活化作用，可刺激炎性细胞释放，损伤机体呼吸道上皮，诱发呼吸道高反应状态，是哮喘疾病发生发展中关键炎症递质之一［8］。另外，有研究证实，维生素D缺乏会损伤肺功能，提高哮喘急性发作频率［6］，而临床主要以25（OH）D作为维生素D主要评估指标。但关于血清OPN、25（OH）D、LTB4联合对BA的诊断价值仍需进一步探究。基于此，本研究综合分析血清OPN、25（OH）D、LTB4水平在BA病儿诊断及预后中的应用价值。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取南阳医学高等专科学校第一附属医院2017年9月至2019年9月收治的BA病儿104例作为观察组，年龄范围为2～9岁，体质量范围为14.0～34.5 kg；另选取同期健康体检儿童98例作为对照组，年龄范围为2～8岁，体质量范围为14.3～34.2 kg。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。两组性别、年龄、体质量均差异无统计学意义（P＞0.05），而在过敏史、呼吸道反复感染史、母乳喂养等方面差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 儿童支气管哮喘104例与健康体检儿童98例一般资料比较

纳入标准：（1）观察组均符合国内公认的、并已获临床肯定的儿童支气管哮喘诊断金标准，即《儿童支气管哮喘诊断与防治指南2016年版》［9］中BA诊断标准；（2）两组临床资料完整，监护人均签署知情同意书。

排除标准：（1）先天性心肺疾病者；（2）合并钙磷代谢性疾病者；（3）近12周内有补充维生素D者；（4）合并肝肾等重要脏器器质性病变者；（5）合并支气管肺发育不良、支气管异物、胃食管反流或其他疾病者；（6）存在吸入用布地奈德混悬液、孟鲁司特钠咀嚼片等药物过敏史者；（7）中途放弃治疗、临床资料不完整者；（8）监护人精神行为异常。

1.2 方法

1.2.1检测方法空腹取5 mL静脉血，离心12 min，3 000 r∕min，分离取血清。

（1）采用酶联免疫吸附法检测血清OPN、LTB4水平，试剂盒购自上海卡努生物科技有限公司，具体操作：取出所需板条，设置标准品孔、样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50 μL，同时样本孔中加入待测样本50 μL，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔、样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

（2）采用电化学发光分析仪（型号：Cobas e411）检测血清25(OH)D水平，仪器购自美国罗氏公司，上述均严格按照仪器、试剂盒说明书操作。

1.2.2治疗方法观察组均接受规范化分级治疗，并每次雾化吸入1～2 mL布地奈德混悬液（Astra-Zeneca Pty Ltd，批号H20140474）+3 mL氯化钠溶液（0.9%），每次15～20 min，2次∕天，控制其氧流量为5 L∕min，坚持治疗1周，雾化吸入完成后指导病儿清水及时漱口。同时每晚口服孟鲁司特钠咀嚼片（Merck Sharp & Dohme B.V.，批号J20130054），6～9岁儿童，每次5 mg，1次∕天，2岁以上6岁以下儿童，每次4 mg，1次∕天，均持续治疗4周。

1.3 观察指标（1）对比两组治疗前血清OPN、25（OH）D、LTB4水平。（2）分析血清OPN、25（OH）D、LTB4单一及联合应用对儿童BA的诊断价值。（3）采用儿童哮喘控制测试（Childhood asthma control test，C-ACT）［10］评估预后，总计27分，其中C-ACT评分≤19分为未控制；20～22分为部分控制；C-ACT评分≥23分为控制。对比不同预后病儿治疗前、治疗第7天、第14天血清OPN、25（OH）D、LTB4水平变化趋势。（4）治疗第14天血清OPN、25（OH）D、LTB4与儿童BA预后的关系。

1.4 统计学方法使用SPSS 23.0进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，均通过正态性检验，以±s描述。两组间的比较采用两独立样本t检验。两组不同时间点比较采用两因素重复测量数据的方差分析+两两组间比较LSD-t检验+两两时间比较差值t检验。计数资料以例数及率描述，两组间比较采用χ2检验或校正χ2检验。通过绘制ROC曲线分析血清OPN、25（OH）D、LTB4对儿童BA的诊断效能。治疗14 d后血清OPN、25（OH）D、LTB4与预后的关系采用非条件logistic回归。

本研究统计推断的检验水准α=0.05。重复测量分析之时间维度的多次比较按Bonferroni校正法调整检验水准。

2 结果

2.1 两组血清OPN、25（OH）D、LTB4水平观察组治疗前血清OPN、LTB4高于对照组，血清25（OH）D低于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 儿童支气管哮喘104例与健康体检儿童98例血清OPN、25（OH）D、LTB4水平比较∕±s

表2 儿童支气管哮喘104例与健康体检儿童98例血清OPN、25（OH）D、LTB4水平比较∕±s

注：OPN为血清骨桥蛋白，25（OH）D为维生素D，LTB4为白三烯B4。

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2.2 儿童发生BA危险因素的二元logistic回归分析以儿童是否存在BA为应变量，赋值：1=有支气管哮喘，0=无支气管哮喘的健康体检者。以组间基线数据、血清OPN、25（OH）D等单因素分析中P＞0.1的指标为自变量，建立非条件logistic回归模型。采用逐步后退法进行二元logistic回归分析，结果显示，有过敏史、有呼吸道反复感染史、父母有哮喘史以及治疗前血清OPN、LTB4，25（OH）D均是儿童BA的独立影响因素（P＜0.05），见表3。

表3 儿童发生支气管哮喘危险因素的二元logistic回归分析

2.3 血清OPN、25（OH）D、LTB4对儿童BA的诊断价值进一步探讨血清OPN、25（OH）D、LTB4对儿童BA的诊断价值如下：（1）各指标的单独应用。以观察组为阳性样本，对照组为阴性样本，建立ROC诊断分析模型，被分析指标按样本总水平数值范围划分为若干个组段，建立ROC曲线。再以软件拟合之ROC曲线读取约登指数最大值点，对应计算理论阈值和敏感度、特异度。经ROC分析知，该指标具有较高的诊断价值，AUC（95%CI）分别为0.790（0.728～0.844）、0.771（0.706～0.827）、0.809（0.748～0.861）。分析结果列于表4，ROC分析曲线见图1。

（2）各指标的联合应用.采用SPSS软件的联合应用ROC理论模式（LogP模式：对各单独应用指标进行综合回归，建立logistic预测∕诊断评估模型，并将三指标转化得到的联合应用预测概率的预测变量，并据此进行联合应用的ROC分析）。结果显示，联合应用对儿童BA的诊断的AUC（95%CI）为0.892（0.841～0.931）。提示其诊断效能均较单一指标均有明显提高。亦见表4和图1。

表4 治疗前血清OPN、25（OH）D、LTB4单独及联合应用对儿童支气管哮喘104例的诊断效能

图1 治疗前血清骨桥蛋白（OPN），维生素D［25（OH）D］，白三烯B4（LTB4）单独及联合应用对儿童支气管哮喘104例诊断的ROC曲线

2.4 不同预后病儿治疗前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平变化趋势经有效治疗后，104例BA病儿中48例控制，36例部分控制，20例未控制。

对比不同预后病儿治疗前、治疗第7天、第14天血清OPN、25(OH)D、LTB4水平变化趋势，组间和时间对各指标的影响均存在交互作用（P＜0.05）。进一步对内因素单独效应进行分析，组间单独效应：三组间治疗第7天、第14天各指标水平均差异有统计学意义（P＜0.05）；时间因素单独效应：时间因素对三组各指标的影响均差异有统计学意义（P＜0.05）。两两精细比较，治疗第7天、第14天控制者、部分控制者血清OPN低于治疗前，25(OH)D高于治疗前（P＜0.017）；控制者治疗第7天、第14天血清OPN、LTB4低于部分控制者、未控制者，25(OH)D高于部分控制者、控制者（P＜0.05）。见表5。

表5 不同预后支气管哮喘病儿治疗前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平变化趋势∕±s

表5 不同预后支气管哮喘病儿治疗前后血清OPN、25（OH）D、LTB4水平变化趋势∕±s

注：OPN为血清骨桥蛋白，25（OH）D为维生素D，LTB4为白三烯B4。①与组内治疗前比较，P＜α'，α'为Bonferroni校正后的检验水准=0.05∕3=0.017。②与控制者同时点比较，P＜0.05。③与部分控制者比较，P＜0.05。

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2.5影响儿童BA预后的单因素分析将儿童BA治疗后预后情况分为预后不良（未能控制）和控制良好（控制和部分控制），并进行单因素分析，结果显示，预后不良的BA病儿治疗第14天OPN、LTB4明显高于控制良好病儿，而治疗第14天25（OH）D明显低于控制良好病儿（P＜0.05）。见表6。

表6 影响儿童支气管哮喘预后的单因素分析

2.6 儿童BA预后影响因素的二元logistic回归分析以儿童BA预后为应变量，赋值：1=预后不良（未能控制），0=控制良好（控制和部分控制）。以单因素分析中P＞0.1的指标为自变量，建立非条件logistic回归模型。采用逐步后退法进行二元logistic回归分析，结果显示，治疗第14天血清OPN、LTB4，25（OH）D均是预后不良的独立影响因素（P＜0.05），见表7。

表7 儿童支气管哮喘预后影响因素的二元logistic逐步回归分析

3 讨论

目前临床尚未完全明确BA发病机制，大量研究认为，Th1∕Th2失衡可能是BA发病的主要免疫学基础，能在一定程度上促进炎性细胞因子及IgE大量释放，诱发变态反应［11］。因此，积极探索BA发病机制，对BA诊断及预后评估均具有重要指导意义。

OPN是临床公认的Thl型免疫反应的关键细胞因子，在Thl细胞及Th2细胞介导的Ⅳ型、Ⅰ型变态反应中发挥重要作用［12-13］。王仁忠等［14］研究发现，BA病儿血清OPN水平呈上升趋势，支持本研究结果。推测OPN可能参与BA发生、发展。OPN通过与多种炎症递质、细胞因子相互作用，间接参与中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞趋化、浸润过程，进而增殖支气管平滑肌细胞，上调基质金属蛋白酶-9、白细胞介素13等表达，参与气道组织重塑，诱导气道炎症持续存在，从而促进BA病情进展。通过绘制ROC曲线进一步证明，血清OPN诊断BA的AUC较大，具有较好的诊断效能。另外，治疗第7天、第14天血清OPN水平在控制者、部分控制者中呈低表达，与兰芙蓉等［15］研究结论相似，且治疗第14天OPN也是影响儿童BA预后的独立危险因素，有力佐证了OPN水平下调会发挥抗炎作用，抑制气道炎症反应，防止肺组织及气道组织重塑，提高支气管平滑肌肌动蛋白表达，减小基底膜厚度，预防气道纤维化，从而BA病儿临床预后。

LTB4可活化白细胞，对中性粒细胞产生强效化学诱导反应，介导相关黏附蛋白表达，从而增加血管通透性，促进黏液分泌［16-17］。本研究结果显示，血清LTB4水平在BA病儿中呈异常高表达，与熊璎珞［18］结果基本一致，证实了LTB4在BA发作中具有重要作用。血清LTB4水平高表达，可能通过与其主要功能受体BLT1相互作用，促进中性粒细胞、效应T细胞等细胞因子趋化与活化，参与细胞因子网络调节，刺激白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α等炎性递质释放，从而加重气道嗜酸性粒细胞炎症，引发BA。ROC曲线表明，血清LTB4诊断BA的AUC也很大，可见早期检测血清LTB4浓度，对BA病儿具有一定诊断价值。而治疗第14天血清LTB4是BA病儿预后不良的独立影响因素提示通过抑制血清LTB4产生，控制以嗜酸性粒细胞增多及浸润为主的慢性气道炎症，有望成为治疗BA研究新的方向。

Man等［19］研究证实，维生素D在非特异性免疫及特异性免疫中发挥重要作用，可调节辅助性T细胞Th1、Th2活性。通过电化学发光分析仪检测可知，BA病儿血清25（OH）D水平明显低于健康体检儿童，与Prasad等［20］研究相符，充分说明BA病儿存在维生素D缺乏现象。BA发生会增强气道局部炎性反应，抑制血清25（OH）D水平释放，进而降低白细胞介素10水平，破坏Thl∕Th2平衡，提高Th2分泌细胞活性，增加小气道阻塞程度，提高气道高反应性，增加BA急性发作风险［21-22］。本研究发现，治疗第14天血清25（OH）D是BA病儿预后不良的独立影响因素。分析原因可能与维生素D水平升高，一方面可调节Th1、Th2细胞亚群，控制促炎因子的释放，改善炎症反应，进而减轻慢性气道炎症；另一方面可调控支气管平滑肌组织基因转录，促进其相关蛋白表达，减少气道重塑，增强糖皮质激素作用，从而缓解哮喘症状有关。而血清25（OH）D对儿童BA同样具有较高的诊断效能（AUC＞0.7）。本研究进一步采用联合诊断模式，结果表明，血清OPN、25（OH）D、LTB4联合诊断BA的AUC和敏感度最高，提示三指标联合应用对儿童BA具有更高的诊断价值。综上所述，血清OPN、25（OH）D、LTB4水平在BA病儿中呈异常表达，三者联合应用有望成为BA的更有效的早期诊断手段，并为临床选择针对性治疗方案及预后评估提供参考。