稽留流产绒毛染色体通量测序技术检测235例结果分析

张羽，刘琰，李兰兰，李丽

稽留流产（missed abortion，MA）指胚胎或胎儿死亡后滞留于宫腔未能及时排出的一种流产类型［1］。其病因复杂多样，包括染色体、内分泌、感染、免疫、解剖等因素的影响，且仍有50%病因不明。在不明原因自然流产中，染色体异常可达50%～85%［2］。本研究回顾性分析我院稽留流产病人绒毛染色体基因拷贝数检测（genomic copy number variations，CNVs）及核型分析结果，进一步明确流产病因，从而更好地做出遗传学咨询、改善妊娠结局。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2018年8月至2019年8月西北妇女儿童医院生殖妇科稽留流产病人235例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。其纳入标准：年龄范围20～45岁，孕龄7～12周，此次妊娠经B超动态监测为空孕囊或未见胎心搏动或胎心搏动消失者诊断为稽留流产，且妊娠期间无感染，无放射线、毒物接触史，无生殖系统结构异常，无高血压、糖尿病等内外科合并症。所有病人签署知情同意书。

1.2 研究方法稽留流产病人流产后收集绒毛组织10 mg，用生理盐水冲洗残留血液、剔除其他组织。采用Qiagen Blood & Tissue（德 国Qiagen GmbH）进行绒毛DNA提取，随后进行文库制备（EZGALO），最后采用高通量测序仪（NextSeq CN 500）进行测序。最后，将所测结果与人类基因组数据库进行匹配比较。

1.3 统计学方法应用SPSS 18.0进行统计学分析。计量资料采用±s表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绒毛高通量测序染色体检测结果235例稽留流产病人绒毛染色体检测结果中，有70例（29.79%）结果正常，165例（70.21%）存在异常现象。其中染色体数目异常有118例（71.5%），染色体结构异常有47例（24.48%）（表1）。

表1 稽留流产病人235例绒毛染色体检测结果∕%

2.1.1染色体数目异常结果在染色体数目异常中（n=118），以非整倍体为主，其中三体所占比例最高——46.7%（n=77），以16、22、21、15-三体最为高发。而所有的双重三体均为21或22-三体合并其他三体（表2）。性染色体非整倍体包含1例三体（47，XN，+X）及7例单体（均为45，X）。嵌合体包含三体嵌合体、单体嵌合体、两性嵌合体，其中三体嵌合体可见不等数量的3、17、18、20-三体。在235例病人中，除了1、19-三体未发现，其余编号染色体均可见三体存在。

表2 6例染色体双重三体详情

2.1.2染色体结构异常结果47例染色体结构异常的位点不同、拷贝数大小不等，导致其致病性不同。经查询对比DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共数据库资源可得，未知致病性占55.32%（n=26）、多态性占25.53 %（n=12）与已知致病性19.15%（n=12），其中已知致病详情见表3。

表3 已知致病性染色体结构异常病人9例详情

所有未知致病性的异常拷贝数范围为0.12～3.64 Mb，多态性为0.28～1.06 Mb，已知致病性为0.24～99.42 Mb。

2.2 染色体异常与病人年龄、妊娠方式及流产次数的关系与三体组年龄（32.55±4.65）相比，双重三 体 组 年 龄（38.67±3.14）明 显 偏 高（t=4.41，P＜0.05）。而染色体正常组年龄较异常组偏低（P＜0.05），且年龄＜35岁组染色体异常发生率明显低于年龄≥35岁组（P＜0.05）；染色体的异常率与病人妊娠方式及既往流产次数无关（P＞0.05）。见表4。

表4 稽留流产235例绒毛染色体异常相关因素分析

3 讨论

稽留流产发病率高，且病因不明、复杂多样［3］，检测稽留流产病人染色体异常情况，有助于寻找流产原因，最终缓解病人及其家庭身心压力［4］。

有数据报道，早期流产中胚胎染色体异常率可达50%～60%［5-8］。常规的G带核型分析被用作检测染色体非整倍性和不平衡的金标准，但此方法失败率较高、易受母体细胞污染、只能检测特定的染色体异常［9］，可造成结果偏差［10］。而高通量测序技术作为第二代测序的代表，拥有高通量、高精准、低成本、易操作等优势［11］，因而应用广泛。并且范宝光等［12］指出，高通量基因测序技术能发现稽留流产绒毛染色体的微缺失或重复，为检测染色体结构异常开辟了新的途径，有望成为稽留流产绒毛染色体检测的主要手段。

本研究正是采用高通量测序技术检测235例稽留流产病人绒毛染色体异常情况及基因拷贝数，最终可得染色体异常率为70.21%，与Jurkovic D等［2］报道相近。

染色体异常包括数目与结构的异常，其中以染色体数目异常为主［13］。本研究结果中，染色体数目异常占71.5%（包括双重三体及嵌合体），其中非整倍体可达染色体异常的54.55%。有文献表明，大多数非整倍体的发生是因为卵母细胞第一次减数分裂错误所致［3］。而非整倍体改变中以染色体三体为主，并以16-三体出现频次最高。与本研究一致：16-三体所占比例最高（33.77%），紧随其后的有22-三体（19.48%）、21-三体（15.58%）、15-三体（5.19%）。但与大多数非整倍体发生原因不同的是，16-三体的发生可能与父系第一次减数分裂未分离关系更加密切［14］。虽然16-三体在早期流产中所占比例极高，但并不能完全说明16-三体是导致流产的主要因素。因其他染色体的异常可能会直接导致胚胎不着床而降低检出率，或其异常染色体并不致死，可持续至孕中、晚期。此外，本研究所出现的77例三体中，除了1、19号染色体未发现三体外，其余编号染色体均存在染色体三体现象［15］，且大部分文献均未见1-三体报道［16］。

本研究所有嵌合体占异常总数的16.9%，且嵌合类型不一。其中7例单体均为45，X（Turner综合征），占非整倍体的7.8%。Turner综合征在新生女婴中发病率约达1∕5 000，临床病例多见，常表现为身材矮小、性腺发育不良［17］。由于正常与异常细胞系比例不定，此结果不一定反映真实水平。

染色体结构异常包括重复、缺失、异位、倒位、插入等，本研究中数目异常与重复、缺失、重复与缺失并存。因高通量测序技术准确率、灵敏度均较高，可检测100 kb以上片段大小。此235例样本中发现了0.12～99.42 Mb大小不等的异常片段，拥有较高的染色体异常检出率，增加了诊断的准确性。如上所述，基因异常的位点及大小不同，导致的致病性亦不同；但未知致病性及多态性的异常片段相对较小，易于得到基因补偿而无临床特殊症状表现。

年龄是影响妊娠的一大重要因素，年龄越大、流产率越高［18］。女性随着年龄的增长，卵子质量会相应下降，且高龄会增加染色体不分离现象，从而导致非整倍体的发生。本研究进一步证明，染色体异常组病人年龄（32.08±4.52）明显高于正常组（30.19±3.62），且 年 龄≥35岁 组 染 色 体 异 常 率（83.92%）较正常组（65.92%）偏高。而表2显示，双重三体病人的年龄（38.5±3.27）异常偏高，考虑高龄更易导致双重三体的发生。而妊娠方式与染色体异常率并无相关关系，这与一项Meta分析结果相一致［19］。且本研究表明流产次数与染色体的异常率亦无明显必然联系。虽在6例双重三体中，除了1例病人为自然妊娠，其余均为人类辅助生殖技术助孕，分析其原因可能为样本数较小，且病人有不孕史、年龄偏大，因此采取了人类辅助生殖技术。

综上所述，早期流产的主要原因仍以胚胎染色体异常为主。高龄可增加胚胎染色体的异常风险，但妊娠方式及既往流产次数对胚胎染色体并无明显影响。高通量测序技术可准确、快速地检出染色体异常率及异常情况。