表观遗传学与缺血性卒中后氧化应激的相关性研究进展

王誉博，李子孝，3，4，王拥军，3，4

在我国，卒中是居民死亡和成人致残的首位病因，其中缺血性卒中患者比例超过80%，70%～80%的患者因功能残疾不能独立生活，为我国的经济带来了沉重负担[1]。在缺血性卒中带来的患者、家庭及社会的负担日益加重的背景下，现有的静脉溶栓及血管内取栓等治疗方法，都无法彻底修复卒中带来的神经功能损伤。缺血性卒中后神经功能缺损大多认为与局部脑血流量的显著减少导致氧气和营养物质的缺乏并导致细胞死亡相关，目前许多研究表明氧化应激在其中发挥了重要作用[2]。

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。缺血性卒中后，在脑缺血/再灌注过程中会产生大量的氧自由基（氧化剂），引起氧化应激，导致氧化性神经元死亡，尤其是线粒体功能障碍等[3]。因此，抑制氧化应激可能成为缺血性卒中治疗的新方向。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达的可遗传变化，这些变化包含不同的基因表达模式[4]。表观遗传过程利用广泛的机制促进染色质状态的形成和维持，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等[4-7]。除此之外，表观遗传过程的特殊在于其是可逆的，其染色质的状态是动态的，会根据局部环境的变化做出反应[4]。综上，了解表观遗传调控如何影响血管神经单元中的氧化应激，对寻找缺血性卒中的特异性治疗靶点具有重要意义。

1 DNA甲基化与缺血性卒中后氧化应激

DNA甲基化主要是指CpG岛胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，通常能够在不改变DNA序列的前提下，通过转录抑制来调节全局和特异性基因表达，是最早被发现和研究最广泛的表观遗传调控机制之一[8]。在一项利用表观基因组全关联研究方法（epigenome-wide association studies，EWAS）评估DNA甲基化与缺血性卒中关系的研究中，研究者使用Infinium 450K和EPIC BeadChip在一个队列（252例缺血性卒中患者和43位正常者）中评估了差异甲基化位置（differentially methylated positions，DMPs）和差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs），在另一个队列（618例缺血性卒中患者和243位正常者）中评估了重复的DMPs和卒中亚型之间的关系，使用EpiDISH在相关CpG位点上分析了差异甲基化细胞类型（differentially methylated cell-type，DMCT），最终，使用孟德尔随机化方法对相关CpG位点进行了通路富集分析和因果关系分析，结果发现：所有重复的DMPs都与心源性、动脉粥样硬化血栓形成和不明原因的卒中风险增加相关；DMCT分析表明，自然杀伤细胞在其中发挥了重要作用；通路富集分析显示氧化应激等特定途径基因过表达[9]。

DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMT）是介导DNA甲基化的重要因素，包括DNMT3A和DNMT3B（从头甲基化）以及DNMT1（维持甲基化）[10]。缺血性卒中后导致机体氧化应激水平升高，产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS），ROS/RNS可直接对胞嘧啶进行化学修饰，将5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC），抑制DNMT1和甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBP）结合到DNA，改变甲基化模式[11]。此外，过氧化物还会引起核碱基修饰，如5-氯胞嘧啶可模拟5-mC并在CpG序列中诱导不正确的DNMT1甲基化，导致基因沉默。这些研究均证明缺血性卒中后氧化应激和表观遗传调控之间存在联系[12-13]。

Hcy代谢对于DNA甲基化至关重要，是表观遗传调控机制中的关键途径。Hcy水平升高已被认为是缺血性卒中的危险因素[14-15]。Hcy代谢受损常引起血浆中Hcy浓度升高（高同型半胱氨酸血症），导致氧化还原失衡和氧化应激增加[16]，诱发动脉粥样硬化斑块形成，进而引发各种心脑血管事件，主要包括缺血性心脏病和缺血性卒中[17]。

除此之外，缺血性卒中后氧化应激会导致神经细胞整体DNA甲基化水平升高，而DNMT抑制剂可以减轻缺血后氧化应激引起的神经损伤[18]。例如，5-Aza-脱氧胞苷（5-Azadeoxycytidine，5-Aza-dC）通过抑制DNA甲基化缩小了大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠的脑梗死体积，具有神经保护作用，这可能与缺血后神经细胞功能恢复有关，但其中的具体机制仍不明确[19]。同时，也有研究者有不同的发现：在一项关于血液DNA甲基化和缺血性卒中的研究中，研究者发现缺血性卒中患者普遍存在血液长散布核元件-1（long interspersed nuclear elements-1，LINE-1）的低甲基化，同时纵向分析显示，LINE-1甲基化水平较低的人发生缺血性心脏病和缺血性卒中的风险较高且总死亡率较高[20]。

综上所述，DNA甲基化和缺血性卒中后氧化应激存在显著的联系，但其中所涉及的具体表观遗传机制仍有待更深入的研究。

2 组蛋白修饰和缺血性卒中后氧化应激

越来越多的研究表明组蛋白修饰在心脑血管发育、骨骼形成等多种生物学过程中扮演着重要的角色，尤其在调控神经细胞的生命周期中具有重要地位[21-22]。细胞内组蛋白包裹DNA形成核小体，多种组蛋白修饰酶可改变DNA构象，导致核小体重新定位，进而激活或抑制转录。组蛋白修饰包括乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化和磷酸化等。研究者发现组蛋白修饰酶的调节在缺血性卒中中有重要作用。

2.1 组蛋白乙酰化/去乙酰化 组蛋白乙酰化/去乙酰化是一个重要的翻译后修饰，其所引起的染色质结构重塑是表观遗传调控的重要机制[23]。组蛋白乙酰化/去乙酰化与转录激活/抑制有关，并分别被两个作用相反的酶调控，即组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HATs）和组蛋白去乙酰酶（histone deacetyltransferase，HDACs）[24]。动物实验证明HDACs在缺血性卒中过程中发挥作用，多种HDACs的表达水平随着时间的推移而发生不同的改变：急性脑缺血后HDAC1和HDAC2表达水平呈时间依赖性下降；HDAC5的表达水平在再灌注3 h后呈时间依赖性下降；HDAC6和HDAC11的表达水平在再灌注3 h内升高，但随着时间的推移，其表达水平也开始下降[25-26]。一项针对缺血性卒中及其亚型的欧洲人群全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）发现，编码HDACs蛋白的HDAC9基因变异可导致卒中发生风险显著升高[27]。

过氧化物酶是神经保护性抗氧化酶，可保护神经元免受卒中后氧化应激失衡造成的损伤。然而，其活性位点半胱氨酸在卒中后因过氧化而失活，失去对神经元的保护作用。神经突触活性（synaptic activity）可以促进神经元中过度氧化的过氧化物酶（hyperoxidized peroxiredoxins）减少，并诱导硫氧还蛋白（Srxn1）和sestrin 2蛋白（Sesn2）的表达。研究显示sestrin 2蛋白启动子通过活性依赖性组蛋白乙酰化激活转录。通过用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）处理神经元增强组蛋白乙酰化，可以诱导sestrin 2蛋白和硫氧还蛋白的表达[28]。同时，保护剂量的TSA可减少因氧化应激而损伤的神经元中过氧化的过氧化物酶的生成[28]。

除此之外，在小鼠缺血性卒中模型中发现，缺血再灌注3 h，HDAC3、HDAC6和HDAC11的表达显著增加，而使用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）选择性抑制HDAC3或HDAC6，显著改善了氧化应激后皮质神经元的存活情况，提示缺血性卒中后干预特定HDAC亚型表达可能成为新的治疗方法[26]。研究者在体外细胞实验中发现，神经元细胞和胶质细胞在氧-葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）60 min后，HDAC1、HDAC2、HDAC3表达水平上调，其中HDAC3表达水平上调幅度最大[29]。也有研究表明HDAC4和HDAC5表达水平在脑缺血/再灌注损伤和OGD模型中均显著降低，NADPH氧化酶介导的HDAC4和HDAC5表达通过高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1）信号通路导致脑缺血损伤，因此抑制NADPH氧化酶活性可改善脑缺血/再灌注损伤[30]。这些都表明了HDAC的不同亚型在卒中后氧化应激中发挥不同的作用并参与卒中后氧化应激的进程。

研究者在缺血性卒中小鼠实验模型中发现泛HDAC抑制不仅保护神经元免受氧化应激，并通过促进热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）等神经保护因子的表达增加起到一定的治疗作用[31]。但HDAC抑制剂对多种中枢神经细胞的毒性，阻碍了其在神经系统疾病治疗中的应用。最近有研究表明，神经元损伤导致HDAC6表达增加，而抑制HDAC6则可以促进神经元的存活和再生，选择性抑制HDAC6避免了与泛HDAC抑制相关的细胞死亡[32]。因此，HDAC6可能成为一种潜在的无毒治疗靶点，用于改善以氧化应激诱导的神经变性和轴突再生不足为特征的包括缺血性卒中在内的中枢神经系统损伤[32]。

综上所述，虽然已有部分研究证明了组蛋白乙酰化/去乙酰化与缺血性卒中后氧化应激的关系，但其特定亚型和具体机制仍不清楚，阐明特定HDAC在大脑中的作用以及开发特异性的治疗策略治疗卒中可能会带来更有益的结局。

2.2 组蛋白的其他修饰 除了组蛋白乙酰化/去乙酰化，组蛋白修饰还包括组蛋白甲基化/去甲基化、组蛋白磷酸化和组蛋白泛素化等。同组蛋白乙酰化/去乙酰化一样，其他组蛋白修饰方式在卒中后氧化应激中的作用机制也未明确。

随着组蛋白去甲基化酶（histone demethylase，HDM）的发现，人们对组蛋白甲基化的了解也变得更多[33]。尽管已经发现了越来越多的组蛋白甲基化酶（histone methylase，HMT）和HDM，但组蛋白甲基化在卒中后的作用仍然不明。在一项动物实验中，研究者发现与年轻雌性小鼠相比，年老雌性小鼠星形胶质细胞的组蛋白3的四位赖氨酸（histone H3 at lysine 4，H3K4）甲基转移酶活性降低，缺血性梗死体积增大[34]。通过染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，ChIP-seq），研究者发现与年老雌性小鼠相比，年轻雌性小鼠在转录起始位点的组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，H3K4me3，转录增强子）富集的峰增多，而组蛋白第三亚基九号赖氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 9 on histone H3 protein subunit，H3K9me3，转录抑制子）富集的峰减少，表明缺血后年老雌性小鼠星形胶质细胞中染色质活性较低[34]。通过H3K4me3富集基因的DAVID聚类分析，研究者将250个基因富集在7个簇中，基因富集最多的簇基因本体论（gene ontology，GO）分析注释结果为“细胞运动”，其他簇为“细胞繁殖、细胞凋亡调节、DNA损伤、离子结合、转录调节和磷酸化调节”，同时，京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达上调，VEGF是一种血管生成因子，可诱导内皮细胞增殖、抑制细胞凋亡并促进细胞迁移，在脑缺血后神经发生、细胞保护和恢复中起着重要作用[34]。这些数据表明随着年龄的增长，星形胶质细胞的染色质活性降低，加强了对衰老相关卒中严重程度差异的可能机制的见解。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）是一种染色质修饰酶，可特异性去除H3K4上的甲基并诱导转录抑制，这是表观遗传转录激活的特定标签之一。研究表明脑缺血再灌注损伤后，LSD1的表达在时间和空间上发生变化，表明LSD1可能参与卒中后的神经再生[35]。同时，LSD1是一种黄素依赖性胺氧化酶，其可以刺激雄激素受体依赖性转录，将氧气转化为过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）[36]。因此，LSD1参与氧化反应，其在卒中后氧化应激调节中的作用值得更深入的研究。

除了组蛋白甲基化和乙酰化外，在脑缺血后也会发生组蛋白磷酸化。研究表明离子型谷氨酸受体的过度激活会增强氧化应激，导致缺血和癫痫等神经损伤后的神经元死亡，而组蛋白翻译后修饰可能是检测和修复氧化应激损伤（包括DNA损伤）的关键方式，因此可能会影响以过度释放谷氨酸为特征的损伤后的神经元存活[37]。缺血后过度活跃的谷氨酸受体增加了氧化应激并诱发了神经元中的磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）增多，γ-H2AX随着卒中进展而积累，但这种情况可以通过抗氧化剂预处理得到改善[37]。IκB激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）复合物是核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路经典激活的核心成分，研究发现在铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase，SOD1）敲除小鼠中，短暂性局灶性脑缺血后，NF-κB诱导激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）（IKKα的上游激酶）、磷酸化IKKα（phosphorylation of IKKα，pIKKα）和磷酸化组蛋白H3（phosphorylation of histone H3，pH3）（Ser10）水平增加[38]。进一步研究发现，OGD诱导氧化应激后小鼠脑内皮细胞中pH3增强，导致细胞死亡。用IKKα小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）治疗可显著减少 OGD后的细胞死亡。这些结果表明，氧化应激相关的NIK、IKKα和pH3的增加与脑缺血后的细胞死亡有关[38]。

综上所述，不同类型的组蛋白修饰在缺血性卒中后氧化应激中都发挥着重要但不确切的作用，需要进一步阐明。

3 非编码RNA与缺血性卒中后氧化应激

功能性非编码RNA在基因表达中发挥着重要作用，可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，其中，短链非编码RNA中的微小RNA（microRNA，miRNA/miR）与多种卒中危险因素有关，包括动脉粥样硬化和高血压等[39-40]。miRNA是大约22个核苷酸的小RNA分子，在基因组水平对基因表达进行调控，主要表现为转录后负调控。研究表明，miR-424可缩小缺血/再灌注后的梗死体积并抑制神经元凋亡，降低皮质中的ROS和丙二醛水平，总体来说miR-424通过抑制氧化应激来预防短暂性脑缺血/再灌注损伤[41]。miR-210是一种受缺氧诱导因子和Akt激酶依赖性途径调节的重要miRNA，研究表明其表达增加与迷走神经刺激调节脑缺血/再灌注的氧化还原状态有关，是针对脑缺血/再灌注损伤神经保护的潜在靶点[42]。在小鼠中，miR-137通过抑制Src依赖性MAPK信号通路减弱氧化应激、凋亡和炎症通路，从而对缺血性卒中产生神经保护作用[43]。脑组织中最丰富的miRNA为miR-124，研究表明miR-124在脑缺血后的外周血和脑血管内皮细胞中表达上调，实验证实miR-124可通过激活PI3K/AKT/Nrf2通路增加热休克蛋白表达，从而抑制氧化应激和细胞凋亡来保护小鼠嗜铬细胞瘤细胞株（pheochromocytoma-12，PC-12）免受糖氧剥夺离体脑缺血/再灌注诱导的损伤[44]。

miRNA在缺血性卒中病理生理机制中的作用成为近年来的研究热点之一，除去单纯的机制研究，未来利用miRNA进行靶向治疗也可能成为新的探索方向。

缺血性卒中后脑损伤包括卒中后炎症反应、氧化应激、线粒体功能紊乱、血脑屏障破坏等导致的细胞死亡和神经功能缺损等。近年来，氧化应激反应在缺血性卒中后脑损伤中的作用越来越受到人们的关注。大量研究证实卒中后氧化应激与表观遗传机制之间存在紧密联系，但其中的机制是复杂且不清的，需要更深入的研究探索表观遗传机制在卒中后氧化应激中的具体作用。基于此，未来通过干预表观遗传调控，改善卒中后氧化应激失衡带来的脑损伤，可能成为缺血性卒中治疗的新方向。