右归丸干预相关疾病的分子信号通路研究进展

鲁莎 谭从娥

右归丸源自于中医经典《景岳全书》中的补肾名方，以“益火之源”培右肾元阳为制方根本，以“阴中求阳”为立方理论[1]。该方由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂、制附子十味中药组成，方中肉桂、附子与鹿角胶合用温补肾阳、填精益髓，熟地黄、山茱萸、山药、菟丝子、枸杞子、杜仲合用滋肾阴、补肝脾，当归养肝补血，十药合用温补肾阳，补血填精[2]。现代药理研究发现右归丸具有调节免疫功能、骨代谢、神经系统等多方面作用，在临床上治疗膝骨关节炎、卵巢早衰、骨质疏松等疾病效果显著[3]。右归丸的临床疗效虽已得到证实，然其疗效机制目前仍未完全阐明。信号通路是细胞信息传递及其功能发挥的基本途径，研究证明右归丸可能通过调控某些特定功能的分子通路而发挥治疗作用。因此，本文对近年来右归丸具有调控作用的主要分子信号通路进行综述。

1 核转录因子相关通路

核转录因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)是在B淋巴细胞中发现的核转录因子，因为它与免疫球蛋白κ轻链的增强子B序列特异性结合并促进表达而得名。NF-κB通常与抑制蛋白IKB结合成三聚体复合物，存在于未受刺激的细胞质中，可以迅速释放进人细胞核而不需要重新合成蛋白。该转录因子由Rel蛋白家族不同成员组成，如p65蛋白 (RelA)、p50蛋白、p52蛋白、c-Rel蛋白和RelB蛋白等，可激活参与应激反应、炎症和程序性细胞死亡(凋亡)的多种基因。NF-κB/IKB复合体被磷酸化和泛素化后，NF-κB暴露出其核定位序列并从细胞质中进入到细胞核中，与核内DNA上的特异性序列相结合，继而启动或增强相关基因的转录[4]。NF-κB转录因子控制着影响免疫反应的基因表达[5]。研究发现，右归丸对肾阳虚证的调控与NF-κB信号通路相关。谭从娥等[6]研究发现肾阳虚证引起的免疫紊乱状态患者服用右归丸治疗后，其在Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)介导的髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信号通路中，MyD88,NF-κB的mRNA表达明显上调，证明右归丸通过该通路纠正肾阳虚证免疫紊乱状态。

NF-κB通路同时也是一种促炎通路，主要基于NF-κB在促炎基因表达中的作用，包括细胞因子、趋化因子、黏附分子[7]。白细胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)在磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,PKB/Akt)/NF-κB信号通路中可能作为该通路的下游调控分子，与炎症反应有关[8]。动物实验表明，右归丸可抑制膝骨关节炎大鼠炎症反应，表现为降低PI3K/Akt/NF-κB信号通路中的PI3K和pAkt及MMP-14蛋白和IL-6的表达，从而改善膝骨关节炎病变[9]。右归丸还可通过干预NF-κB/SREBPs通路减少炎症因子释放，表现为抑制血清中白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的炎性因子含量，使主动脉组织 TLR4、NF-κB p65、胆固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1c和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)mRNA的表达下降[10]。此外，在右归丸含药血清干预经脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的单核细胞(THP-1)源性泡沫细胞制备的高胆固醇模型中，发现右归丸可能通过抑制NF-κB通路中NF-κB 、p65和SREBP-1c的表达调节血脂，并且通过降低炎症因子的释放预防动脉粥样硬化[11]。

上述研究表明右归丸通过增强NF-κB通路免疫基因的转录调控肾阳虚证免疫功能，抑制该通路的促炎基因表达减少炎症因子释放缓解炎症反应。表明右归丸在NF-κB通路存在双向调节作用，且在缓解炎症反应方面是通过多条通道发挥疗效，展现了右归丸多靶点、多通道的特点，提示右归丸可能对NF-κB通路相关免疫类、炎症类的疾病发挥治疗作用。

2 WNT/β-Catenin经典信号通路

WNT是一类高度不溶蛋白，其通过与细胞膜上的受体结合继而引发下游一系列信号转导。WNT通路分为β-Catenin蛋白依赖性经典通路和非依赖性通路(本文主要介绍经典通路)[12]。该通路控制着大量与生长和代谢相关的基因表达，同时，WNT通路与小肠组织稳定性、毛囊发生、骨密度、造血干细胞分化等生理功能有密切关系[13]。

在WNT/β-Catenin经典通路中，WNT蛋白与受体结合，膜上信号通过Dsh蛋白解体APC蛋白，β-Catenin的浓度不断升高，进入细胞核，启动下游基因转录[14]。经典的 WNT/β-Catenin通路被认为与成骨细胞的形成有关[13]，成骨细胞功能下降是导致骨质疏松症的主要病理基础[15]。近年研究发现，右归丸通过干预WNT/β-Catenin通路提高成骨细胞功能达到治疗骨质疏松症的作用。如章建华[16]等对肾阳虚证骨质疏松症大鼠服用右归丸药液，发现右归丸含药血清组相较空白血清组可增强细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、WNT/β-catenin信号通路相关因子β-catenin、ERK1蛋白、ERK2蛋白的表达进而促进成骨细胞增殖；李玲慧等[17]研究发现右归丸可以使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)表达水平降低、β-Catenin表达水平升高，激活WNT/β-Catenin通路，提高成骨细胞分泌ALP蛋白的能力；付小卫等[18]研究表明右归丸可以激活WNT/β-Catenin通路调控成骨细胞发育、分化和增值。但目前对右归丸干预WNT/β-Catenin通路治疗骨质疏松症发挥的作用认识尚浅，与之相关的具体下游机制尚未阐明，今后需加强WNT/β-Catenin通路的右归丸基础和临床研究。

此外，有研究发现WNT经典通路异常激活有可能是导致膝骨关节炎滑膜损伤、软骨破坏的主要原因，而右归丸可以抑制WNT经典通路中的WNT1-诱导信号通路蛋白-1 (WNT1-inducible signaling pathway protein 1,WISP1)、WNT1、β-catenin和低密度脂蛋白受体相关蛋白5(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein5，LRP5)mRNA的蛋白质表达从而缓解减轻膝骨关节炎的病变[19]。有文献报道，WNT/β-Catenin通路具有抗炎和促炎功能，该功能是由于抑制或增强NF-κB通路[20]。研究人员在膝骨关节炎模型鼠软骨组织中发现信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)和IL-6表达明显上升，经右归丸干预后STAT3和IL-6的表达明显降低[21]。而IL-6为NF-κB的下游调控分子并与炎症反应有关[8]。本篇第一节已详细阐述右归丸通过干预NF-κB通路减少炎症反应，结合上述两项研究表明右归丸治疗膝骨关节炎是通过WNT/β-Catenin通路和NF-κB通路共同发挥作用，但二者的关联研究目前尚无进展。

3 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶相关通路

3.1 丝裂原活化蛋白激酶信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一类能被不同细胞外信号如神经递质、细胞因子、激素等刺激的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK的激活是以三级激酶的形式进行，MAPKKK、MAPkk、和MAPK依次磷酸化激活，MAPK进而进入核内参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理病理过程[22]。 JNK蛋白和P38蛋白同属于MAPK家族，但来自于不同的激活途径，JNK/P38通路与许多病理条件相关，包括癌症、中风和炎症性疾病等，所以抑制JNK/P38的药物可能对治疗有积极作用[23]。近年研究中发现，右归丸对于MAPK通路的调控存在双向调节的作用，并且主要集中在JNK/P38途径。NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是肾脏活性氧(reactive oxygen species,ROS)的关键调节因子之一，受NOX4调控的ROS、P38/MAPK在激素抵抗型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)患者肾小球中的表达水平较高[24]。王新斌[25]等建立SRNS大鼠给予右归丸治疗发现大鼠肾组织中JNK、P38蛋白磷酸化水平明显降低，而模型组大鼠肾组织的JNK、P38蛋白磷酸化水平明显升高，提示右归丸通过抑制JNK/P38信号通路达到治疗SRNS作用。此外，在对右归丸干预慢性肾功能大鼠的实验中发现，右归丸可降低P38磷酸化水平，抑制细胞凋亡保护肾功能；同时可使MAPkk磷酸化水平升高，激活迷走神经，使交感神经活性相对降低继而抑制左心室肥厚[26]。综上右归丸在MAPK通路中的双向调节作用可能是由于增强或抑制MAPK家族不同亚族，并为JNK/P38途径相关的疾病治疗提供新选择，其具体机制有待进一步研究。

3.2 雷帕霉素靶蛋白信号通路

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于P13K激酶家族，参与mTORC1和mTORC2两种多亚基蛋白复合物。mTOR是该通路的重要细胞信号中枢，其上游有多条通路汇聚到mTOR调控下游分子，包括生长控制、蛋白质合成、基因表达和代谢平衡[27-28]。收集近年文献研究发现右归丸干预mTOR通路主要表现在两个方面，一是激活mTOR蛋白发挥抗抑郁效应和促进成骨细胞形成；二是抑制mTOR蛋白治疗慢性关节退行性疾病。孕酮是mTOR通路在海马体的重要调节因子[29]，而抑郁症与海马体的减少有关[30]。研究发现通过对抑郁模型大鼠海马脑区自噬水平观察、选用糖水偏好率作为指标，发现右归丸给药组的糖水偏好率较模型组显著升高且海马CA3区LC3蛋白免疫荧光强度较模型组减弱[31]。这是由于右归丸可以增强AKT、mTOR1蛋白磷酸化水平激活mTOR通路，从而对抑郁症模型大鼠发挥抗抑郁效应有积极作用[32]。另有研究发现腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated proteinkinase，AMPK)/mTOR信号通路中AMPK蛋白异常激活导致mTOR蛋白异常抑制，是绝经后骨质疏松症大鼠的机制之一；右归丸通过减少AMPKα基因与磷酸化的p-AMPKα蛋白表达、增加mTOR基因和磷酸化的p-mTOR蛋白表达干预AMPK/mTOR信号通路促进成骨细胞形成[33-34]。此外，骨关节炎是一种常见的慢性关节退行性疾病，其特征是关节破坏和关节炎症[35]。IL-1β是促进骨关节炎软骨降解的主要炎症细胞因子，IL-1β的产生是通过P13/AKT/mTOR通路的激活[36]。研究表明右归丸治疗慢性关节退行性疾病是通过抑制该通路P13K、AKT、mTOR的蛋白磷酸化水平表达[37]。

4 转化生长因子-β相关通路

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGf-β)是TGF蛋白家族中的一员，它是一种双功能调节因子，既可以刺激细胞增殖，也可以抑制细胞增殖[38]。并且TGF-β是一个细胞因子超家族，包括TGF-(β1、β2,和β3)、激活素、抑制素、抗髓质激素、骨形态发生蛋白、生长分化因子、结节和胶质源性神经营养因子，TGF-β信号通路在调节细胞生长、分化、凋亡、血管生成和免疫反应等重要细胞活动中发挥重要作用[39-40]。骨髓间充质干细胞主要分化方向为成骨细胞和脂肪细胞，但骨髓间充质干细胞会随着年龄的增长而逐渐老化，导致成骨细胞生成减少[41]，而TGF家族中的骨形态发生蛋白是成骨细胞形成所必须的信号[42]。有研究表明右归丸含药血清可以上调TGF-β通路中的TGF-β、BMP-7、血清骨钙素的蛋白浓度，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，对于骨质疏松症的防治有积极意义[43]。另有实验结果同样表明右归丸通过TGF-β1/Smad2/3/4通路促进骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化[44-45]。

5 分析与展望

综上，右归丸通过调控NF-κB信号通路、WNT/β-Catenin经典信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路和TGF-β信号通路发挥治疗作用，这些成果有助于解释右归丸的疗效机制，也为临床应用提供更多的参考。但笔者也发现，目前右归丸调控信号通路的基础研究较少，并且右归丸药物成分十分复杂，治疗靶点多、途径多。近年来，生物信息学的分析方法和高通量检测技术已应用于中医药复杂问题的研究中，可为明确右归丸的靶点提供依据，有助于更深入地研究右归丸发挥疗效的具体途径。此外，进一步深入研究右归丸的作用机制，将有助于扩大右归丸临床使用范围。